本发明专利技术属于分子标记技术，具体涉及一种大麻性别连锁的分子标记与应用。其步骤包括，筛选与大麻性别连锁的序列标签位点，设计序列标签位点的引物序列以及序列标签位点多态性分析。本发明专利技术从公共数据库中获得大麻的1个序列标签位点，开发出与大麻性别连锁的2个序列标签位点标记CsM001和CsM002。本发明专利技术提供了2个大麻性别连锁的序列标签位点标记和一次3个引物的复合PCR扩增方法，可应用于大麻苗期性别鉴定及分子标记辅助育种等研究。
Molecular marker and application of a sex linked hemp
The invention belongs to molecular marker technology, in particular to a molecular marker and application of cannabis sex linkage. The steps include screening sequence tagged sites linked to cannabis sex, designing primer sequences for sequence tagging sites, and analyzing polymorphism of sequence tagged sites. The invention obtains 1 sequence tag loci of cannabis from the public database, and develops 2 sequence tagging site markers CsM001 and CsM002 linked to cannabis sex. The present invention provides 2 hemp linked sequence tag loci markers and a compound PCR amplification method with 3 primers, which can be applied to the research of the sex identification and molecular marker assisted breeding in the seedling stage of cannabis.
【技术实现步骤摘要】
一种大麻性别连锁的分子标记与应用
本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种大麻性别连锁的分子标记与应用。
技术介绍
STS（sequence-taggedsite）是序列标签位点的简称，是指基因组中长度为200~500bp，可采用PCR技术将其专一扩增出来。由于STS序列广泛存在于真核生物基因组中，而且随机分布，具有多态性较高和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于遗传关系分析、遗传图谱构建、品种鉴定、基因定位等领域。大麻（CannabissativaL.）为大麻科（Cannabinaceae）大麻属（CannabisL.）。属短日照异花授粉作物，雌雄异株，染色体2n=20，其中一对为性染色体。大麻根据其致幻成瘾成分四氢大麻酚(THC)的含量的高低分为工业大麻和毒品大麻。工业大麻和毒品大麻在形态学上很难辨别。而且大麻是雌雄异株异花授粉作物，因而在品种间易混杂和变异。因此，正确而快速的辨别大麻品种及其性别对于工业大麻产业的良好发展和毒品大麻的稽查工作就显得十分重要。大麻植株有雌株及雄株不同类型，不同性别的植株形态存在较大差异。大麻从种子萌发到开花一般需要3个月以上的时间，在此之前不能从形态上准确判断植株性别，只有在开花时才能从形态上准确判断植株性别，生产上通常采用多留苗，到时雄性植株开花后自然死亡，这样造成极大的浪费。因此，在苗期鉴定出植株的性别，对大麻育种及栽培均具有重要的意义。利用分子标记技术能够克服形态和生理生化指标受环境及发育阶段影响的缺点，从分子水平上在苗期鉴定出植株的性别。大麻STS标记在分子标记辅助育种和遗传多样性分析中得到极大的应用，有关大麻STS标记的专利争夺正逐步展开。但是，我国大麻STS标记开发仍十分有限，仅极少数实验室开始了有关工作。鉴于大麻STS数目多，还有大量的未被发现，且它们具有重要的理论和应用价值，特别是公共数据库中还可能存在大量的STS位点。因此，在我国开展大麻性别连锁的STS的鉴定和应用研究，开发具有我国知识产权的STS标记显得十分迫切和必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：分离和鉴定大麻性别连锁的序列标签位点标记，建立大麻性别连锁的序列标签位点的PCR扩增体系并利用这些分子标记进行大麻苗期性别鉴定。本专利技术实现的技术方案：所述大麻序列标签位点标记编号CSM001和CSM002，所对应的引物序列为SEQIDNO.1-2、2-3所示。所述的大麻序列标签位点标记编CSM001和CSM002，其对应的序列标签位点为SEQIDNO.4：gcatggacctaacgatttccaaaagcgtgcgatttcttctttctgcaattacattctactatggagtgctaggggcagttaattgagattaaatgccaggttcgatcaaaagatctttgaactgcatatccatatattctccacccctatcaattcgcaagatctataaagttttacccaattagttttgagctaatgcaggctattcctgaaacttttgaaacgtttcagtggtccgcaaagaaagaacgtttggtcatctttccttcaaggcaagacttgcgtacaggtaattcacctaagacgatatttttcagtggaccgtctctggtt。从公共数据库中下载大麻序列标签位点，利用Primer3.0软件设计STS引物，利用这些引物对大麻6个不同品种雌雄单株进行扩增。通过1.2%琼脂糖凝胶电泳研究这些引物的PCR扩增特点，得到大麻性别连锁的序列标签位点标记CSM001和CSM002。本专利技术的具体步骤是：(1)大麻序列标签位点引物开发：从公共数据库(G.Mandolino,A.Carboni,S.Forapani,V.Faeti,P.Ranalli,IdentificationofDNAmarkerslinkedtothemalesexindioecioushemp(CannabissativaL.),TheorApplGenet,98(1999)86-92.)中获得1条大麻序列标签位点(sequencetagsite)。利用Primer3（http://www.simgene.com/Primer3）设计2了对引物，其编号为CsM001和CsM002，如表1所示。表1大麻STS标记的引物编号及来源(2)不同大麻品种的基因组DNA提取：采用CTAB法提取大麻2个品种雌雄单株的基因组DNA。(3)一次3个引物的复合PCR扩增方法：PCR反应体积10μL，反应体系组成为50ng·μL–1DNA2.0μL，10μmol·μL–1引物0.25μL(SEQIDNO.1)，10μmol·μL–1引物0.5μL(SEQIDNO.2)，10μmol·μL–1引物0.25μL(SEQIDNO.3)，0.5UTaq酶0.1μL，10mmol·L–1dNTPs0.2μL，10×PCRbuffer1μL，50mmol·L–1Mg2+0.8μL，ddH2O4.9μL。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec,60℃退火30sec,72℃延伸45sec,共10个循环，每个循环退火温度降低0.5℃；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存10min。Taq酶、dNTP等试剂购自上海生工生物技术有限公司，电泳方法为1.2%琼脂糖凝胶电泳。(4)STS的多态性和扩增效率分析：STS的多态性和扩增效率如图1所示。一次3个引物的复合PCR得到强且清晰的DNA带型，分别以汾阳3号（FY）和榆社（YS）大麻的雄株总DNA为模板得到1个400bp和1个300bp的扩增产物，以雌株总DNA为模板仅仅得到1个400bp扩增产物，根据PCR扩增结果，可以将大麻雌雄性别植株一次性鉴定出来。本专利技术的积极效果如下：(1)开发并鉴定了2个大麻的STS标记，经在国际基因数据库中检索，证明为新的STS标记。(2)经将上述STS标记用于大麻雌雄性别植株的鉴定，发现PCR鉴定结果与田间表型结果完全一致。多态性分析和扩增效率结果如图1所示。附图说明图1STS标记(CsM001和CsM002)对汾阳3号（FY）和榆社（YS）大麻雌株（Fn）与雄株（Mn）扩增结果的电泳图，其中M:DL2000。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本专利技术的内容而非限制本专利技术的保护范围。实施例1：开发了2个与大麻性别连锁的STS标记。这2个STS标记编号分别为CsM001和CsM002，如表1所示。实施例2：利用上述开发的STS标记一次性准确的鉴定大麻雌雄性别植株。供试材料为汾阳3号（FY）和榆社（YS）大麻。利用一次3个引物的复合PCR，得到强且清晰的DNA带型。其中，雄株总DNA为模板得到1个400bp和1个300bp的扩增产物，以雌株总DNA为模板仅仅得到1个400bp扩增产物，如图1所示。SEQUENCELISTING<110>福建农林大学<120>一种大麻性别连锁的分子标记与应用<130&本文档来自技高网...
【技术保护点】
大麻性别连锁的序列标签位点标记，其特征在于：所述大麻序列标签位点标记编号CsM001和CsM002，各编号所对应的引物序列为SEQ ID NO.1‑2及SEQ ID NO.2‑3所示。
【技术特征摘要】
1.大麻性别连锁的序列标签位点标记，其特征在于：所述大麻序列标签位点标记编号CsM001和CsM002，各编号所对应的引物序列为SEQIDNO.1-2及SEQIDNO.2-3所示。2.根据权利要求1所述的大麻性别连锁的序...
【专利技术属性】
技术研发人员：张立武，赵铭森，方书生，康红梅，祁建民，高金虎，张列梅，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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