一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法，具体步骤如下：样品蛋白提取；采用Bradford法测定提取的蛋白浓度；蛋白酶解；iTRAQ标记；真空冷冻离心干燥；高pH条件下的反相色谱分离；ABI‑5600进行蛋白质分析；质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析。本发明专利技术能够快速、可靠的蛋白质组学技术方案来发现糖尿病肾虚中的特异性蛋白标记物，为糖尿病肾虚早期诊治、术后复发、转移及预后观察建立一种无创、简便、快捷实用的检测评估手段。

A method for detecting salivary protein markers in type 2 diabetes mellitus with kidney deficiency syndrome

The present invention discloses a method for detecting the saliva protein markers of kidney deficiency syndrome of type 2 diabetes. The specific steps are as follows: sample protein extraction; Determination of protein concentration by Bradford; proteolysis; iTRAQ labeling; vacuum freezing centrifugal drying; reversed phase chromatographic separation under high pH conditions; protein analysis by ABI 5600 Analysis of mass spectrometry data: when the database is selected, the database of the species is selected directly for the sequenced organisms. If it is not sequenced, the database of the large class of proteins which is most related to the sample is selected; the mass spectrometric analysis of iTRAQ is carried out by ABI 5600 mass spectrometer. The invention can quickly and reliably detect the specific protein markers in diabetic kidney deficiency, and establish a non-invasive, simple, quick and practical detection and evaluation method for the early diagnosis and treatment of diabetic kidney deficiency, postoperative recurrence, metastasis and prognosis.

【技术实现步骤摘要】
一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法
本专利技术涉及一种生物标志物检测方法，具体是一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法。
技术介绍
2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)是临床常见的老年代谢紊乱性疾病，生化检查主要表现为患者空腹血糖及(或者)餐后血糖的升高，症状典型者可以同时伴有口干多饮、多食易饥、尿量增多以及体重减轻等表现，在病程后期，患者多出现心、脑、肾等组织器官的血管粥样硬化性病变，导致血管管腔狭窄，从而引起一系列心、脑、肾等组织器官供血不足、代谢障碍甚至衰竭的临床表现。病情危重者，则由于碳水化合物、脂肪、蛋白质等物质代谢严重失常，或者胰岛素使用不当，血糖在短时间内急剧飙升，引起患者出现病情危重的状态，例如糖尿病酮症酸中毒昏迷(DKA)、高血糖高渗性昏迷，倘若抢救不及时，患者多有生命危险。此外，2型糖尿病的致残率极高，有的老年性患者因为血糖反复或持续性升高，出现了白内障、青光眼、失明、尿毒症，甚至肢体坏疽、截肢等严重不良后果，严重影响患者生活质量，增加社会经济负担。目前，随着人们现在生活水平的提高、平均寿命年龄的延长、人口的老龄化以及人们饮食习惯的西方化，我国的2型糖尿病患者人口总数已经高居于世界首位，而且处于快速增长的阶段，与此同时，我国2型糖尿病患者的患病年龄日趋于年轻化，形势非常严峻。机体胰岛素分泌相对不足(胰岛素缺乏)和(或)胰岛素的生物效应降低(胰岛素抵抗)是2型糖尿病患者血糖持续性居高不下的重要原因，是2型糖尿病发病的主要机制。为了更好的防治2型糖尿病，减少或者阻止2型糖尿病的并发症出现，目前已经对其发病机制进行更深层次的研究。例如患者胰岛素分泌或功能减退，除了与体型肥胖、运动过少等环境因素有关外，也跟基因等遗传因素有关，其中基因核转录因子7类似物2(transcriptionfactor7-like2，TCF7L2)是引起2型糖尿病最重要的一个遗传基因，它除了可以通过直接影响β细胞的生长、分化以及功能来干扰胰岛素的分泌，也可以通过间接的引起胰岛功能的缺陷，从而引起血糖的异常。随着科学的进步，人们对2型糖尿病的研究逐渐由基因转向基因表达的蛋白质研究，例如有人发现2型糖尿病患者跟正常人比较，存在唾液激素原转化酶(Prohormoneconvertase，PC)含量明显偏低的现象，这种酶是一种内切蛋白酶，能够对神经内分泌激素的前身进行加工，而且能够作用于胰岛β细胞，使其分泌的胰岛素原去除部分肽段形成胰岛素，其含量的降低则可以导致胰岛素的形成不足，从而引起血糖升高。中医将2型糖尿病归属于“消渴病”范畴，对其有深刻的认识及理解，并创立各具特色的流派及治疗学说，如肾虚论、肾虚论、阴虚燥热论，及从脾论治，从肝论治等。中医药理论治疗2型糖尿病，确实可以提高机体对胰岛素的敏感性，缩减西药的毒副作用及使用剂量，延缓甚至能够有效地防止糖尿病并发症的发生与发展。但是，实际生活中，中医药诊断治疗2型糖尿病并不能够得到很好的重视及广泛运用，其主要的原因就是2型糖尿病的辨证分型方法太过于繁多，缺少可靠的客观性的量化性指标，从而在相当大的程度上影响中医药治疗2型糖尿病的可行性以及具体操作性。因此，要提升2型糖尿病的中医药理论发展，必要先着手2型糖尿病的中医辨证论治理论的现代研究发展。随着现代医学技术的快速发展，运用中西医结合诊治手段研究中医药理论成为一种必然趋势，本课题研究从宏观辨证与微观辨证相结合的思想理念出发，运用唾液蛋白质组学技术探讨2型糖尿病不同证候的微观物质变化，尝试开展2型糖尿病的“病”与“证”相结合的研究，为2型糖尿病临床辨证分型的规范化、客观化提供分子物质基础依据，以期将来能够促进中医药对2型糖尿病的诊断与治疗。随着人类基因组计划(humangenomicproject，HGP)的完成，人们逐渐将研究靶向转变对蛋白质组(proteome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学(proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层次上对蛋白质进行动态研究。蛋白质是生命活动的执行者，是基因表达的产物，其表达、修饰、功能以及彼此相互作用均受到遗传及环境因素的影响，于是机体出现疾病状态必然会引起蛋白质含量或者存在形式的变化，这些变化的蛋白质分子可以为临床疾病诊断的物质基础提供依据。蛋白质组学主要是运用现代先进的检测技术，检测机体从小到一个细胞到大至整个机体的全部基因所表达的蛋白质的特性，比较分析生理或病理状态、用药及不用药状态下的差异表达蛋白质，找出不同状态下个体表达差异的蛋白质，从而为生命的物质基础、疾病的早期检测与诊断等研究寻找分子诊断标志物提供依据。近年来，随着现代科学及生物化学的微量检测分析技术的发展创新，唾液作为一种临床容易采集而且操作过程完全没有创伤性的体液逐渐进入了人们研究活动的视角，且具有无法估计的科研潜力以及临床应用前景。首先，相比血清标本而言，唾液标本的采集更安全，具有无创性，采集过程中患者无痛苦，易于接受，而且无血源性疾病传播的风险存在；与尿液标本相比，唾液标本具有可实时采样、更方便的优点。此外，唾液检测需要的样本量小、成本低、易于储存和运输。最重要的是，唾液标本成分与血液、尿液等体液成分具有极高的相似性，对疾病诊断具有极强的敏感性和特异性。唾液是人体常见的一种重要体液，其包涵大量的激素、蛋白质、酶、抗体、补体、细胞因子及各种微生物等血液成分，这些血液成分通过顺浓度梯度被动的跨细胞膜转运或逆浓度梯度的主动转运等途径分泌在唾液当中，且随体内病理生理变化的影响而呈动态变化过程。研究唾液的PH值、电解质、生化指标、微生物、免疫指标、蛋白质等成分变化与疾病的关系，发现唾液成分的变化可作为疾病诊断、疗效判断、药物监测的参考指标，在临床疾病的诊治活动中具有重要的潜在应用价值。根据目前的文献资料显示，唾液不仅能够作为艾滋病、乙型肝炎等传染性疾病、口腔恶性肿瘤及乳腺癌等恶性肿瘤的诊断标志，而且也可以应用于糖尿病、关节炎、心脏病及肾脏疾病等各个系统疾病的诊断，从而成为目前西方国家研究者热衷的取代血清学检查的首选标本。唾液具有消化食物、润滑、防御保护、缓冲、机械清洗、抗菌以及内分泌等生物作用，而蛋白质和多肽是唾液成分中最主要的具有生物学功能的物质，目前已发现唾液蛋白质和多肽有2300多种，主要有α-淀粉酶、白蛋白、半胱氨酸蛋白酶、IgA、溶菌酶、乳铁蛋白、黏蛋白等蛋白质，其中有98％的唾液蛋白质是富酪蛋白及转铁蛋白。然而，通过对已发现的唾液蛋白质的功能进行分类，发现功能未知的蛋白质占有2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于‑80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI‑TOF‑TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI‑5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI‑5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对糖尿病肾虚证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，糖尿病肾虚证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q07654，基因注释为Trefoil factor 3；2)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonic anhydrase 1(Fragment)；3)检索号为P55000，基因注释为Secreted Ly‑6/uPAR‑related protein 1；4)检索号为Q96FQ6，基因注释为Protein S100‑A16；5)检索号为A8MSP2，基因注释为RAB37,member RAS oncogene family,isoform CRA_e；6)检索号为Q13748，基因注释为Tubulin alpha‑3C/D chain；7)检索号为P01771，基因注释为Ig heavy chain V‑III region HIL；8)检索号为H0YEY4，基因注释为ADP‑sugar pyrophosphatase(Fragment)；9)检索号为P02538，基因注释为Keratin,type II cytoskeletal 6A；10)检索号为Q5JV98，基因注释为Serine/threonine‑protein kinase 24(Fragment)；11)检索号为O14929，基因注释为Histone acetyltransfera...

【技术特征摘要】
1.一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白标记物的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对糖尿病肾虚证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，糖尿病肾虚证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q07654，基因注释为Trefoilfactor3；2)检索号为E5RG43，基因注释为Carbonicanhydrase1(Fragment)；3)检索号为P55000，基因注释为SecretedLy-6/uPAR-relatedprotein1；4)检索号为Q96FQ6，基因注释为ProteinS100-A16；5)检索号为A8MSP2，基因注释为RAB37,memberRASoncogenefamily,isoformCRA_e；6)检索号为Q13748，基因注释为Tubulinalpha-3C/Dchain；7)检索号为P01771，基因注释为IgheavychainV-IIIregionHIL；8)检索号为H0YEY4，基因注释为ADP-sugarpyrophosphatase(Fragment)；9)检索号为P02538，基因注释为Keratin,typeIIcytoskeletal6A；10)检索号为Q5JV98，基因注释为Serine/threonine-proteinkinase24(Fragment)；11)检索号为O14929，基因注释为HistoneacetyltransferasetypeBcatalyticsubunit；12)检索号为P33763，基因注释为ProteinS100-A5；13)检索号为Q5T8U5，基因注释为Surfeit4；14)检索号为A0A087WYI3，基因注释为Folatereceptorgamma(Fragment)；15)检索号为P27169，基因注释为Serumparaoxonase/arylesterase1；16)检索号为P10599，基因注释为Thioredoxin；17)检索号为P03973，基因注释为Antileukoproteinase；18)检索号为H0YM90，基因注释为Tyrosine-proteinkinasereceptor；19)检索号为P04083，基因注释为AnnexinA1；20)检索号为A0A0B4J1X8，基因注释为ProteinIGHV3-43(Fragment)；21)检索号为Q9NU63，基因注释为Zincfingerprotein57homolog；22)检索号为P07355，基因注释为AnnexinA2；23)检索号为E7ENZ3，基因注释为T-complexprotein1subunitepsilon；24)检索号为Q6P452，基因注释为Annexin；25)检索号为P19013，基因注释为Keratin,typeIIcytoskeletal4；26)检索号为B0YJ81，基因注释为Very-long-chain(3R)-3-hydroxyacyl-CoAdehydratase1；27)检索号为P05387，基因注释为60SacidicribosomalproteinP2；28)检索号为P06702，基因注释为ProteinS100-A9；29)检索号为Q9UHG3，基因注释为Prenylcysteineoxidase1；30)检索号为C9JTH1，基因注释为Interleukin-36receptorantagonistprotein(Fragment)；31)检索号为P12277，基因注释为CreatinekinaseB-type；32)检索号为P12724，基因注释为Eosinophilcationicprotein；33)检索号为P13647，基因注释为Keratin,typeIIcytoskeletal5；34)检索号为F5H3X6，基因注释为Prohibitin-2(Fragment)；35)检索号为H7C5G1，基因注释为Isoamylacetate-hydrolyzingesterase1homolog(Fragment)；36)检索号为P49862，基因注释为Kallikrein-7；37)检索号为P08727，基因注释为Keratin,typeIcytoskeletal19；38)检索号为A0A0A0MR85，基因注释为GlutathioneS-transferaseMu4；39)检索号为E9PF10，基因注释为NuclearporecomplexproteinNup155；40)检索号为Q8N4H5，基因注释为MitochondrialimportreceptorsubunitTOM5homolog；41)检索号为H0Y9H2，基因注释为Alpha-adducinFragment；42)检索号为P19652，基因注释为Alpha-1-acidglycoprotein2；43)检索号为P01763，基因注释为IgheavychainV-IIIregionWEA；44)检索号为O43653，基因注释为Prostatestemcellantigen；45)检索号为P60985，基因注释为Keratinocytedifferentiation-associatedprotein；46)检索号为P31150，基因注释为RabGDPdissociationinhibitoralpha；47)检索号为Q9NP55，基因注释为BPIfold-containingfamilyAmember1；48)检索号为P02760，基因注释为ProteinAMBP；49)检索号为Q8IWV8，基因注释为E3ubiquitin-proteinligaseUBR2；50)检索号为Q8N1N4，基因注释为Keratin,typeIIcytoskeletal78；51)检索号为E9PHK0，基因注释为Tetranectin；52)检索号为P05386，基因注释为60SacidicribosomalproteinP1；53)检索号为H0YF61，基因注释为Non-specificlipid-transferproteinFragment；54)检索号为I3L397，基因注释为Eukaryotictranslationinitiationfactor5AFragment；55)检索号为P01770，基因注释为IgheavychainV-IIIregionNIE；56)检索号为Q9NZH8，基因注释为Interleukin-36gamma；57)检索号为I3L1E3，基因注释为Hepatocytegrowthfactor-regulatedtyrosinekinasesubstrateFragment；58)检索号为P13646，基因注释为Keratin,typeIcytoskeletal13；59)检索号为Q14002，基因注释为Carcinoembryonicantigen-relatedcelladhesionmolecule7；60)检索号为P26196，基因注释为ProbableATP-dependentRNAhelicaseDDX6；61)检索号为P14854，基因注释为Cytochromecoxidasesubunit6B1；62)检索号为Q13907，基因注释为Isopentenyl-diphosphateDelta-isomerase1；63)检索号为Q8WWA0，基因注释为Intelectin-1；64)检索号为P07099，基因注释为Epoxidehydrolase1；65)检索号为F8VX90，基因注释为Receptortyrosine-proteinkinaseerbB-3Fragment；66)检索号为Q04695，基因注释为Keratin,typeIcytoskeletal17；67)检索号为Q7L523，基因注释为Ras-relatedGTP-bindingproteinA；68)检索号为A0A087X232，基因注释为ComplementC1ssubcomponent；69)检索号为D6RA82，基因注释为Annexin；70)检索号为P20851，基因注释为C4b-bindingproteinbetachain；71)检索号为A0A0C4DH34，基因注释为ProteinIGHV4-28Fragment；72)检索号为Q9BV57，基因注释为1,2-dihydroxy-3-keto-5-methylthiopentenedioxygenase；73)检索号为A0A0C4DG85，基因注释为Alcoholdehydrogenaseclass4mu/sigmachain；74)检索号为P05141，基因注释为ADP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【专利技术属性】
技术研发人员：吴正治，孙珂焕，黄飞娟，曹美群，丁峰，范大华，姚永超，
申请(专利权)人：深圳市老年医学研究所，吴正治，
类型：发明
国别省市：广东,44