CHO细胞表达牛传染性病气管炎病毒gD蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种CHO细胞表达的重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在牛体内产生较强的体液免疫，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产牛传染性鼻气管炎病毒重组亚单位疫苗的制备方法，所述重组亚单位疫苗制备方法包括以下步骤：1)克隆包含gD蛋白编码基因的真核表达载体；2)转染CHO细胞，通过选择、筛选和驯化的方式得到悬浮稳定高效表达gD蛋白的CHO细胞株；3)发酵培养2)中所述的细胞株，纯化后得到重组gD蛋白；4)将重组gD蛋白与ISA 201 VG充分混匀得到重组亚单位疫苗。本发明专利技术提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达2‑3g/L，不仅缩短蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低疫苗生产成本。

Preparation and application of CHO cell expressing bovine infectious disease virus tracheitis virus gD protein and its subunit vaccine

The invention discloses a method and application of the preparation and application of a recombinant bovine infectious bovine rhintracheitis virus gD protein and subunit vaccine expressed by CHO cells, and proves that the vaccine can produce strong humoral immunity in cattle, which belongs to the field of animal vaccine and veterinary biologics. The aim is to provide a large-scale industrialization. The preparation method of recombinant subunit vaccine for the production of infectious bovine rhintracheitis virus, the preparation method of the recombinant subunit vaccine includes the following steps: 1) clone the eukaryotic expression vector containing the gD protein encoding gene; 2) transfect the CHO cells by the formula of selection, screening and domestication to obtain the CHO fines of the stable and efficient expression of gD protein. Cell strain; 3) the cell strain of 2) was cultured and cultured. After purification, the recombinant gD protein was purified; 4) the recombinant gD protein was fully mixed with ISA 201 VG to get the recombinant subunit vaccine. The method provided by the invention can harvest the target protein from the cell culture supernatant, and the yield is up to 2 3g/L, not only shortening the time of protein purification and simplifying the production steps of the vaccine, but also greatly reducing the cost of the vaccine production.

【技术实现步骤摘要】
CHO细胞表达牛传染性病气管炎病毒gD蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用
本专利技术涉及一种稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的CHO细胞系及牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白亚单位疫苗的制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品

技术介绍
牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisvirus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性传染病，它以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征。该病毒还可引起母牛生殖系统损害，导致流产、死胎等，有时还会引发肠炎、小牛脑炎、眼结膜炎和角膜炎等。该病对奶牛的产奶量、牛群的肥育率及繁殖力均有较大的影响，并且急性的IBR呼吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎。该病于20世纪50年代初最早报道于美国，但目前在世界范围内流行。我国1980年首次从新西兰进口种牛中发现此病，目前在大部分省份的奶牛、黄牛和水牛均有IBRV感染。流行病学调查显示，我国14个养牛主要省份IBRV平均感染率为33.3％，给我过养牛业造成巨大的经济损失。IBRV基因组由一个长独特区(UL,106kb)和一个短独特区(Us,l0kb)及Us区两侧的重复序列IRs和TRs组成，IBRV基因组为双股线性DNA分子，约138kb。整个基因组编码33个结构蛋白和15个非结构蛋白，其中四个糖蛋白gB、gC、gD和gE是IBRV的主要抗原，而gD蛋白是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，是IBRV的主要结构蛋白，同时也是IBRV复制的必需基因，是刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白，它不但能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，因此gD是制备IBRV检测抗原和疫苗的首选基因。CHO细胞是1957年美国科罗拉多大学TheodoreT.Puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，CHO细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000L以上，可以大规模生产。CHO细胞类型较多，如：DG44、DXB11、CHO-K1和CHO-S等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是DHFR(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为DG44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是DG44的DHFR体系。GS(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以CHO-K1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比DHFR系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是GS在ATP水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(L-methioninesulfoximine，MSX)，可使GS基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的CHO-K1细胞株作为宿主细胞；(2)CHO-K1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。本专利技术成功构建并筛选了稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的CHO细胞株，克服了表达牛传染性鼻气管炎病毒gD囊膜糖蛋白对细胞毒性作用。该细胞株表达gD蛋白水平高、易于纯化、生产，并且低剂量的gD蛋白抗原能在牛体内诱导产生高水平的免疫反应。该细胞株表达抗原所制备的疫苗可为牛传染性鼻气管炎病毒的预防提供新型、高效的预防制剂，它将对我国乃至世界范围内牛传染性鼻气管炎病毒的预防控制发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可大规模工业化生产的牛传染性鼻气管炎病毒的亚单位疫苗的制备方法和应用。本专利技术提供了一种CHO细胞分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白。本专利技术的技术方案中，优选的，所述含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒是先将牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因进行密码子优化，然后克隆到真核表达载体中，得到重组质粒。本专利技术的技术方案中，优选的，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因如SEQIDNO.1所示。本专利技术的技术方案中，优选的，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白为(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQIDNO.2所示的氨基酸组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术的技术方案中，所述含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因的真核表达载体可以为pEE6.4、pEE12.4、pGL4.13、pcDNA3.1，优选的，真核载体为pEE12.4。本专利技术的技术方案中，所述CHO细胞可以为DG44、DXB11、CHO-K1、CHO-S细胞株，优选的，所述高度表达的菌株为悬浮稳定高效表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的CHO-K1细胞株。本专利技术的技术方案中，优选的，所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA201VG。本专利技术的技术方案中，优选的，所述重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白与佐剂ISA201VG按体积比46:54混合乳化。本专利技术还提供了一种重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白和牛传染性鼻气管炎病毒重组亚单位疫苗在制备及相关诊断试剂中的应用。本专利技术构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的CHO细胞株，该细胞株表达gD蛋白产量高、易于纯化、易于大规模生产，且表达的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原能对牛免疫诱导产生良好的免疫反应；由该重组gD蛋白制备的亚单位疫苗具有以下优点：1.大规模生产、供量充足、质控容易；2.安全性高、免疫原性好；3.批次间稳定；4.生产成本低。附图说明图1表示pEE12.4-OPTI-gD质粒图谱。图1为实施例2得到的质粒图谱，表示质粒的构建，通过EcoRI及HindIII两个酶切位点将优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)将牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述细胞株，纯化后得到重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)将牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述细胞株，纯化后得到重组牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因的重组质粒是先将牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因进行密码子优化，然后克隆到真核表达载体中，得到重组质粒。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白编码基因如SEQIDNO.1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱泓，吴有强，卞广林，张强，吴素芳，车影，宋月鸿，吕洋萍，陈滨，查银河，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33