一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法技术

本发明专利技术涉及属于细胞与乙肝疫苗免疫应答技术领域，尤其是指一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法。本发明专利技术提供一种新颖的乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法，用Tfh细胞检测人体乙肝疫苗接种后免疫应答，突破了以往研究辅助性T(Th)细胞与乙肝疫苗免疫应答的关联思想，为以后研究乙肝疫苗弱应答机制提供了一个全新、有效的思路，对新型疫苗研制、HBV感染的防治具有重要作用。

A method for detecting immune response after hepatitis B vaccination

The invention relates to the field of cell and hepatitis B vaccine immune response technology, in particular to a detection method of immune response after vaccination of hepatitis B vaccine. The invention provides a novel method for detection of immune response after hepatitis B vaccination, and uses Tfh cells to detect the immune response after hepatitis B vaccine inoculation. It breaks through the previous study of the associated thought of the immune response of T (Th) cells and hepatitis B vaccine, and provides a new and effective method for the future study of the mechanism of the hepatitis B vaccine weak response. The train of thought will play an important role in the development of new vaccines and the prevention and treatment of HBV infection.

【技术实现步骤摘要】
一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法
本专利技术涉及属于细胞与乙肝疫苗免疫应答
，尤其是指一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法。
技术介绍
乙肝病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是一个全球性公共卫生问题，迄今没有满意的临床治疗方法。实践证明接种疫苗是预防控制HBV感染最经济有效的策略与措施。但接种乙肝疫苗的健康人群中有5％-10％不能产生足够的抗体，表现为乙肝疫苗弱应答，该人群仍对HBV易感。乙肝疫苗弱应答的发生机制尚不清楚，因为乙肝疫苗激发机体免疫反应是T细胞依赖的，所以国内外绝大多数学者认为，T细胞的辅助作用是乙肝疫苗弱应答发生的关键，自乙肝疫苗推广使用以来，辅助性T(Thelpercell,Th)细胞一直是乙肝疫苗弱应答发生机制研究的热点，但主要的靶细胞多集中在Th1、Th2细胞。近年研究发现：体液免疫应答中，主要辅助B细胞的是滤泡辅助性T(Tfollicularhelpercells,Tfh)细胞，Th1、Th2细胞及其分泌细胞因子只在B细胞活化和Ig类别转化中起调节作用，辅助性T(Thelpercell,Th)细胞对B细胞的的活化作用比较弱。Tfh细胞特征性表达标记为CXCR5、PD-1、ICOS等，并且国内外大量研究者将CXCR5+CD4+T细胞定义为Tfh细胞。但在Tfh细胞是否参与乙肝疫苗免疫应答方面，国内外鲜有研究。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的问题提供一种新颖的乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法，用Tfh细胞检测人体乙肝疫苗接种后免疫应答，对以后研究乙肝疫苗弱应答机制提供了一个全新、有效的思路，为新型疫苗研制、HBV感染的防治具有重要作用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)接种对象的选取：结合常规免疫规划工作，在乙肝疫苗接种人群中招募志愿者，询问相关信息，选取合适乙肝疫苗接种对象；2)采集血液样本：对符合标准的乙肝疫苗接种对象，采用静脉采血方式采集乙肝疫苗接种对象血液样本；3)处理血液样本：从步骤2)的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，采用流式细胞术检测Tfh细胞数；4)乙肝疫苗的接种：向接种对象注射乙肝疫苗；5)血液样本的采集与处理：5.1)7天后采集其血液样本，从采集的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，采用流式细胞术检测Tfh细胞数；5.2)14天后再采集其血液样本，从采集的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，采用流式细胞术检测Tfh细胞数。所述接种对象的选取的标准为：1)完成3针乙肝疫苗接种程序；2)最近1年内未接种过乙肝疫苗；3)既往未感染乙肝病毒；4)无基础性疾病；5)愿意全程参与实验，并服从实验安排。排除标准：1)对疫苗存在过敏反应；2)实验期间发生感染性疾病。所述乙肝疫苗：采用20μg重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母，葛兰素史克生物制剂公司)；所述接种方式为上臂外侧三头肌，肌内注射。所述静脉采血的步骤包括：(1)确定采血时间：编号研究对象，根据实验对象乙肝疫苗接种时间，预约安排采血时间；(2)采血前准备：在采血管上贴好标签，填写采血者编号和采血次数；穿戴好工作服，消毒洗手，戴上手套与口罩；(3)选择采血静脉：要求被采血者坐在实验台前，面对采血者，手平放在桌面，掌心向上，肘部垫一枕垫。采血部分常选择肘前静脉，备选于手背部静脉；(4)扎压脉带，消毒皮肤：在肘窝上8cm处系上压脉带，要求被采血者紧握和放松拳头几次，使得静脉显现。用碘伏棉签消毒采血部位，再用75wt％酒精棉签擦拭消毒部位；(5)采血与止血：打开一次性静脉采血针包装，取出采血针，以45°斜刺进皮肤，进入静脉内时有刺空感，见有少量回血后将采血针的另一端插入真空采血管内，每管到达采血8mL，每个人每次共采3管；采血完毕，用棉签按住采血针头部位，快速拔出针头，要求被采血者按住棉签不少于3分钟；所述分离出血浆的方式为：将采集的血液样本在采血管静置30分钟，待有血浆析出，每管收集200μL血浆，在-80℃下保存；所述密度梯度离心法分离外周静脉血单核细胞(PBMC)方法包括以下步骤：(1)分别取20mL静脉血与20mLPRMIMedium1640培养基，将静脉血样与PRMIMedium1640培养基放入50mL离心管，混合均匀，得到总体积为40mL的混合液；(2)取5个15mL离心管，用移液管向每个离心管加入4mL淋巴分离液；(3)将步骤(1)中的混合液用移液管沿着管壁缓慢加入已加入淋巴细胞分离液的15mL离心管中，每管加8mL混合血样，最终保证静脉血、PRMIMedium1640、淋巴细胞分离液的体积比为1：1：1；(4)在1200rcf/min、室温、升降速度为升1降2的条件下，离心25min；(5)离心结束后离心管内液体分四层，从低到高依次为：红细胞层、淋巴细胞分离液层、单核细胞层、血浆与PRMIMedium1640混合液层，取5个15mL的离心管，分别用移液管吸取单核细胞层，分别转移到15mL的离心管中；(6)分别向步骤(5)的离心管中再加入PRMIMedium1640至管内液体有12mL，混合均匀；(7)在300rcf/min、室温、升降速度为升9降9条件下，将步骤(6)所得离心管离心10min；(8)离心结束后，弃上清液，用200uLPRMIMedium1640重悬细胞，所有重悬液均转置一个管内；(9)取5uL混合均匀的细胞悬液，用PRMIMedium1640稀释10倍后，取20μL加入细胞计数板内，经细胞计数仪计数。流式细胞术：通过检测Tfh细胞标记的荧光信号，对Tfh细胞进行定量分析和分选的技术；所述流式细胞术检测步骤为：(1)取十万个外周血单核细胞(PBMC)置于1.5mL离心管中，用1mL缓冲溶液重悬细胞，得到重悬液；(2)在300rcf、室温条件下，将步骤(1)中的所得的重悬液离心10min；(3)弃上清液，再用100μL缓冲溶液重悬细胞，加流式抗体(PerCP-Cyanine5.5CD4、PECXCR5)各5μL作为细胞表面标记物，用移液器轻轻吹打混匀，避光室温孵育30min；(4)孵育结束后加入1mL缓冲溶液重悬细胞，得到重悬液；(5)在300rcf、室温条件下，将步骤(1)中的所得的重悬液离心10min；(6)弃上清液，用400uL2wt％多聚甲醛固定细胞，用流式细胞仪检测细胞表面标记物。所述缓冲溶液为磷酸缓冲盐溶液、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白的混合溶液，所述缓冲溶液按照每1L磷酸缓冲盐溶液中加入2mMol乙二胺四乙酸、5g牛血清白蛋白制成。本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种新颖的乙肝疫苗接种后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)接种对象的选取：结合常规免疫规划工作，在乙肝疫苗接种人群中招募志愿者，询问相关信息，选取合适乙肝疫苗接种对象；2)采集血液样本：对符合标准的乙肝疫苗接种对象，采用静脉采血方式采集乙肝疫苗接种对象血液样本；3)处理血液样本：从步骤2)的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Tfh细胞数；4)乙肝疫苗的接种：向接种对象注射乙肝疫苗；5)血液样本的采集与处理：5.1)7天后采集其血液样本，从采集的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Tfh细胞数；5.2)14天后再采集其血液样本，从采集的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Tfh细胞数。

【技术特征摘要】
1.一种乙肝疫苗接种后免疫应答的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)接种对象的选取：结合常规免疫规划工作，在乙肝疫苗接种人群中招募志愿者，询问相关信息，选取合适乙肝疫苗接种对象；2)采集血液样本：对符合标准的乙肝疫苗接种对象，采用静脉采血方式采集乙肝疫苗接种对象血液样本；3)处理血液样本：从步骤2)的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Tfh细胞数；4)乙肝疫苗的接种：向接种对象注射乙肝疫苗；5)血液样本的采集与处理：5.1)7天后采集其血液样本，从采集的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Tfh细胞数；5.2)14天后再采集其血液样本，从采集的血液样本中分离出血浆和淋巴细胞，采用ELISA法检测血浆中HBsAb水平；使用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用流式细胞术检测Tfh细胞数。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述接种对象的选取的标准为：1)完成3针乙肝疫苗接种程序；2)最近1年内未接种过乙肝疫苗；3)既往未感染乙肝病毒；4)无基础性疾病；5)愿意全程参与实验，并服从实验安排；6)对疫苗不存在过敏反应；7)实验期间未发生感染性疾病。3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述静脉采血的步骤包括以下步骤：(1)确定采血时间：编号研究对象，根据实验对象乙肝疫苗接种时间，预约安排采血时间；(2)采血前准备：在采血管上贴好标签，填写采血者编号和采血次数；穿戴好工作服，消毒洗手，戴上手套与口罩；(3)选择采血静脉：要求被采血者坐在实验台前，面对采血者，手平放在桌面，掌心向上，肘部垫一枕垫。采血部分常选择肘前静脉，备选于手背部静脉；(4)扎压脉带，消毒皮肤：在肘窝上8cm处系上压脉带，要求被采血者紧握和放松拳头几次，使得静脉显现。用碘伏棉签消毒采血部位，再用75wt％酒精棉签擦拭消毒部位；(5)采血与止血：打开一次性静脉采血针包装，取出采血针，以45°斜刺进皮肤，进入静脉内时有刺空感，见有少量回血后将采血针的另一端插入真空采血管内，每管到达采血8mL，每个人每次共采3管；采血完毕，用棉签按住采血针头部位，快速拔出针头，要求被采血者按住棉签不少于3分钟。4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述分离出血浆的方式为：将采集的血液样本在采血管静置30分钟，待有血浆析出，每管收集200μL血浆，在-80℃下保存。5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述密度梯度离心法分离外周...

【专利技术属性】
技术研发人员：余祖卫，李玉莲，许晓佳，
申请(专利权)人：东莞市大朗镇社区卫生服务中心，
类型：发明
国别省市：广东,44