真菌细胞壁结构性多糖的制备方法技术

本发明专利技术涉及用作吸附带负电物质、吸附重金属离子和用作生物体的吸附固定化载体的真菌细胞结构性多糖，它是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，通过破碎，醇洗，碱洗及加双官能团试剂交联等一系列物化处理得到的，在中性或酸性溶液中呈正的表面电势，含有相当多的自由胺基，并持有天然的多孔网状结构，其吸附量大，吸附力强，又不溶于酸碱溶液，具有很好的稳定性，易再生使用。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用作吸附带负电物质、吸附重金属离子和用作生物体的吸附固定化载体的真菌细胞壁结构性多糖及其制备方法。几丁质或壳聚糖是结构类似于纤维素的胺基多糖生物聚合物，由于它们具有丰富的自由胺基和凝胶性的特性，被广泛用作生物吸附剂，重金属离子吸附剂和包埋固定化载体，其不足之处在于几丁质含自由胺基含量少，吸附量小，性能差于壳聚糖；但壳聚糖易溶解于有机溶剂和酸性溶液，故作为生物吸附剂，其操作稳定性较差，也无法再生利用；在用作重金属离子吸附时，为提高操作稳定性，需通过交联或螯合，虽可使稳定性有所提高，但同时也失去了部分自由胺基，致使吸附量下降，还增加了成本；而利用凝胶性，用作酶、微生物或动植物细胞的包埋固定化载体，存在着传质阻力大，不利于氧和其他营养物质的及时供应(Scott，R.T.et al，Enzyme Micro.Technol.，10151-155，1988)，固定化细胞内的细胞增殖会使固定化细胞破裂，导致细胞渗漏等缺点；此外，几丁质或壳聚糖大都从虾蟹等甲壳纲动物的壳中制备而得，不仅原料来源受虾、蟹生长周期、季节、气候条件、捕捞量等因素制约，且在制备过程中需强酸强碱以及高温的作用，耗能巨大还会造成环境污染。鉴于上述，本专利技术的目的是提供一种吸附量大、吸附力强、不溶于酸碱、稳定性好、易再生的真菌细胞壁结构性多糖。本专利技术的另一个目的是提供一种制备本专利技术的真菌细胞壁结构性多糖的方法。本专利技术还有一个目的是将本专利技术的真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂、重金属离子吸附剂和生物固定化载体的应用。本专利技术的真菌细胞壁结构性多糖是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，用下述方法得到1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶剂去除交联剂；得到在中性或酸性溶液中呈正的表面电势的真菌细胞壁结构性多糖。这种真菌细胞壁结构性多糖以胺基已糖—葡聚糖为主，通常，为使其具有好的吸附性能，而使它的自由胺基含量不低于0.8％(重量)为好，折合成胺基己糖(几丁质或壳聚糖)不低于8％(重量)。本专利技术提供的制备真菌细胞壁结构性多糖的方法是，以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，包括以下步骤1)对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；对于真菌菌丝体，一般来讲，真菌细胞壁通常含胺基己糖(壳聚糖和几丁质)，但以接合菌纲(如毛霉属、犁头霉属、根霉属)、子襄菌纲(黑曲霉、青霉)、担子菌纲和半知菌纲真菌细胞壁为多，其它真菌则含量较少。这些真菌可以按普通培养法进行液体悬浮培养。培养基可以是天然的(土豆汁培养基)，也可以是半合成的(蛋白胨或牛肉浸膏等加葡萄糖或蔗糖)，亦可以是完全合成培养基(碳源以葡萄糖或蔗糖或糖蜜为主，氮源以硝酸铵或硫酸铵或硝酸钠为主，再加维生素)。在温度32～37℃，通气量0.5～2.0vvm及转速300～500rpm的通气搅拌罐中，经过3～5天的培养，菌丝体得到大量繁殖。用金属丝网收集发酵液中的菌丝体。此菌丝体可用作细胞壁的原材料。当然，亦可直接采用工厂出来的真菌(如黑曲霉、米根霉及青霉等)菌丝体废料。物理破碎可采用传统的机械法，如研磨，沙振动及高速剪切法，也可以采用超声波法及冷冻破碎法。破碎程度以100微米以下为好，这样能保证以后物化处理的完全性。破碎以后，菌丝体用水冲洗，使原生质去除干净。2)醇洗，除去细胞壁上的类脂；醇可以采用50％(v/v)的甲醇、乙醇，但以乙醇为优。去类脂效果以温度选在40～60℃，搅拌速度选在200～500rpm为好。3)用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；碱溶液是可溶性的氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钙或氨水。所用碱浓度取决于具体的真菌种类。对于根霉、梨头霉及毛霉，碱浓度以0.2～2.0N为优，而对于曲霉及青霉，碱浓度以2.0～6.0N为优，一般也以温度选在40～60℃，搅拌速度选在200～500rpm为好。若采用酶，则可用蛋白酶来除蛋白质，核酸酶来除核酸。4)用双官能团试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶剂去除交联剂；这样就可使自由壳聚糖结合于网状的细胞壁结构性多糖络合物上。双官能团试剂可以是戊二醛、甲醛、环氧氯丙烷及甲苯二异氰酸酯等，一般，用量为5～20％(重量)，在室温下反应四小时后除去交联剂。若交联反应发生在自由胺基上，会使吸附性能大大下降，则可采用在交联反应前加入苯甲醛先进行自由胺基保护，交联反应后再用稀盐酸除去苯甲醛。因该交联发生在温和的条件下，一般情况下不需要胺基保护这一步骤。所得真菌细胞壁结构性多糖可以长期保存在2％醋酸溶液中直接使用。若需用于上柱操作，可以通过挤压造粒及干燥后以备用，其颗粒直径以1～2mm为宜，保证兼有好的机械强度与传质性能。本专利技术的真菌细胞壁结构性多糖含有相当多的自由胺基，并保持了细胞壁的多孔网状结构，它在中性或酸性溶液中呈正的表面电势，所以对带负电有机物、对重金属离子具有很好的吸附性能，此外，它不溶于酸碱溶液，具有很好的稳定性，易再生使用。用专利技术的真菌细胞壁结构性多糖作为生物吸附剂很容易吸附带负电的有机物或高分子物质，如蛋白质(包括酶与激素等)、核酸。由于该细胞壁结构性多糖长链上有多个吸附位点而且极为柔软易形变，在吸附的同时又能起架桥作用，这双重的作用使细胞壁结构性多糖非常有利于将悬浮颗粒去除。除此，专利技术的真菌细胞壁结构性多糖是天然吸附剂，不含任何有毒化学物质，特别适合于处理食品的后加工工序，如澄清饮料等。还可用于食品行业的废水处理，如鱼粉废水及屠宰废水等。当吸附了蛋白质等两性物质的真菌细胞壁结构性多糖与原溶液分离后，在搅拌的情况下用稀酸(如醋酸)或稀碱处理细胞壁结构性多糖时，吸附了的蛋白质便重新溶解到稀酸或稀碱溶液中，通过过滤或离心法将细胞壁结构性多糖与蛋白质溶液分开，就可被完全再生。真菌细胞壁结构性多糖作为重金属离子吸附剂应用，吸附容量大，易再生。因为它主要由壳聚糖与葡聚糖络合物组成而不含其它易腐败物质，所以更易于保存与操作。用本专利技术的真菌细胞壁结构性多糖作为微生物或动植物细胞或酶的生物固定化载体，只需将载体放于含被固定的细胞或酶液中，轻微搅拌后，静置即可得到固定化细胞或酶。由于这些生物体带负电，很易被表面带正电的真菌细胞壁结构性多糖所吸附。载体与所固定的细胞或酶之间的结合力比较强，使固定化细胞或固定化酶能稳定于离子强度高及酸碱溶液中，并能承受激烈的搅拌环境。以下实例将进一步说明本专利技术，但它们不是对本专利技术的限定。实例中，将真菌细胞壁结构性多糖简称为细胞壁结构性多糖。本专利技术的真菌细胞壁结构性多糖的制备方法实例实例1将黑曲霉、毛霉、犁头霉及米根霉分别培养在蔗糖含量为10％的土豆汁培养基。在温度35℃，通气量1.0vvm及转速300rpm的通气搅拌罐中，经过4天的培养后，菌丝体用金属丝网收集。菌丝体用水冲洗，再置于高速破碎机中剪切6分钟。此破碎过的菌丝体用水充分淋洗，在光学显微镜下检查可见菌丝体内已无原生质。然后用乙醇萃取细胞壁半小时后，再用2.0N的氢氧化钠溶液进行两次脱蛋白质的处理，醇洗或碱洗，其温度均为50℃，搅拌转速均为300rpm。然后，用水洗至中性后，过滤，再经5.0％(重量)戊二醛交联，室温下进行交本文档来自技高网...

【技术保护点】
真菌细胞壁结构性多糖，其特征是以含壳聚糖或几丁质的真菌菌丝体为原料，用下述方法得到：１）对真菌菌丝体进行物理破碎、水洗，去除胞内原生质；２）醇洗，除去细胞壁上的类脂；３）用碱溶液或酶除去细胞壁上的蛋白质及核酸；４）用双官能团 试剂进行交联反应，然后用有机溶剂或水溶液去除交联剂；得到在中性或酸性溶液中呈正的表面电势的真菌细胞壁结构性多糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟琴，吕德伟，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]