虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控剂制造技术

本发明专利技术公开了虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，包括虎斑乌贼神经肽LFRFamide，神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(open reading frame，ORF)567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’‑UTR)91bp，3’非编码区(3’‑UTR)202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。制备得到的虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂对虎斑乌贼的色素囊变化调控、取食和生殖活动均有影响，可优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。

Neuropeptide LFRFamide reproductive regulator of squid

The invention discloses a sepia pharaonis neuropeptide LFRFamide reproductive control agent, including tiger squid, neuropeptide LFRFamide, neuropeptide LFRFamide gene cDNA full-length 860bp, open reading frame (open reading frame, ORF 567bp), encoding 188 amino acids, 5 'non encoding region (5' UTR 91bp 3 '), non encoding area (3 UTR) 202bp, the relative molecular mass of precursor protein (MW) was 21.5kDa, isoelectric point (pI) was 9.40. The prepared control agent of tiger cuttlefish neuropeptide LFRFamide has influence on the regulation of pigment bursa regulation, feeding and reproductive activities of tiger cuttlefish, which can optimize the artificial propagation of tiger cuttlefish in China.

【技术实现步骤摘要】
虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控剂
本专利技术涉及神经肽
，本专利技术具体是一种虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控剂。
技术介绍
头足类（Cephalopoda）属于软体动物门头足纲，广泛分布在各个海域，在生物的系统演化的过程中占有重要地位。其肉质鲜美可口，肌肉含有相当丰富的营养物质，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是还具有重要的研究价值，其墨囊可以促进血液凝固且还含有抗菌成分，海螵蛸可以用作医学药材，耳石可以用来分析物种存在的年轮和海洋环境随时间和空间的变化特点。另外头足类还是海洋生态系统中重要的生物因子，在生态系统食物链中作为捕食者和被捕食者，对维持海洋生态系统的稳定具有重要的作用。神经肽是广泛存在于动物体内的小分子多肽，由神经组织分泌，具有调节神经活动、机体生长、发育等各种生理功能，神经肽同时还能充当生长因子、营养因子等信息分子。神经肽是一类比较古老的信息分子，真菌乃至细菌体内都存在神经肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控剂，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，包括虎斑乌贼神经肽LFRFamide，神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(openreadingframe，ORF)567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-UTR)91bp，3’非编码区(3’-UTR)202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。神经肽LFRFamide生殖调控制剂的制备方法包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、虎斑乌贼LFRFamide核心序列的扩增、RACE获得LFRFamide基因cDNA的全长和序列信息分析。作为优选，总RNA提取步骤为取脑组织样品浸入Trizol，匀浆后静置，加入氯仿后剧烈震荡，静置后离心，取最上层上清液，加入异丙醇摇匀静置，离心后取沉淀，在沉淀中加入70~80%浓度的乙醇，用枪头吹吸沉淀，离心，用枪头吸除液体部分，保留的沉淀即为总RNA。提取的总RNA必须要测定其吸光度R值，一般R值在1.8-2.0之间说明提取出的RNA为有效的总RNA，可以继续为后续操作使用，如果小于1.8则表明提取出的RNA含有较多的杂质，会影响结果的准确性，所以不能使用；如果R值大于2.0则说明提取出来的RNA已经降解，也不能使用。作为优选，cDNA第一链的合成步骤为：利用从脑组织提取的总RNA进行反转录，合成cDNA第一链。作为优选，虎斑乌贼LFRFamide核心序列的扩增步骤为：根据NCBI数据库中已报道的5种软体生物LFRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼LFRFamide基因核心片段；利用已获得的核心片段序列设计5’RACE和3’RACE引物；克隆LFRFamide所需引物为：LFRFamide-F：CAAACGCAACAGCCTCTTCCG；LFRFamide-R：AGTGCGGCTTCGTCCATACC；5’-LFRFamide-outter：GCTGCGTTTTAGTCCTTCG；5’-LFRFamide-inner：TTCGGGGTCGTCCTTGCT；3’-LFRFamide-outter：AGAGACGGACTCGAAGACCTTTACG；3’-LFRFamide-inner：CTCAGCACAACAGGCGGCAGCAAC；5’RACEAdapter：CGAGTCCGTCTCTTTT；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer；GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；以成熟虎斑乌贼脑组织cDNA为模板，利用简并引物LFRFamide-F和LFRFamide-R进行LFRFamide基因核心片段的PCR扩增，PCR扩增程序如下：95℃，5min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，12min；用1%琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化。作为优选，RACE获得LFRFamide基因cDNA的全长步骤为：以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3’RACE未知片段，得到3’端RACE模板cDNA；以虎斑乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增5’RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增5’RACE片段，得到5’端RACE模板cDNA；使用Lasergene软件对LFRFamide基因的3’端、5’端和核心片段的序列进行拼接，从而获得完整的虎斑乌贼LFRFamide基因的cDNA全长序列。作为优选，序列信息分析步骤为：采用在线工具对LFRFamide基因进行开放阅读框（ORF）预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列。其中，LFRFamide基因cDNA全长为：AGCCGAATCGCGTTTCTCATACAGAATACAAAGCAATTCTTAGAACCTGGGCTTAACAAATACAGCGAACCGGCCAACGGTCAGATCAAATATGGAAACAAAAGTGATGAGTTTGTTGGCGACTGTGCTAACCGTGTTCATTGTGCAGATAAATTGCGAAGACCTACACAAAATACAAACAGACACTTCCGGCATTTCTAATTTTATCGGTCTACCAGATGGAGAGGAAGGCGAACTAGTGAGATCCCCGATTGTTGACGAATCAGCGCTCGGCATTGACGATGTCGACAAACGCAACAGCCTCTTCCGATTCGGTAAGCGTGGAAACCTCTTCCGATTCGGTAAACGCGGAAACCTCTTCCGGTTCGGCAAGCGTGGAAACCTCTTCCGTTTTGGACGCGGTGGCAACAAGGACGACCCCGAAAACGAAGGACTCAAACGCACCATCTTTAGATTCGGTAAAAGAGACGGACTCGAAGACCTTTACGACTACGAGGATCCCTCAGTACAACAGGTGGCACCAACAGCTGGAGACAAGCGCGGATCATTCTTCCGGTATGGACGAAGCCGCACTTTCTTCCGATACGGCAGAAGCACTGATAAGAACGCCGAGAAGAGGCCACACACACCCTTCCGATTTGGAAGAGAAGAAGAGTAAACTAATGACTCCATAGAATTTTACCTTAAAAAGATTAAAGAGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，其特征在于包括虎斑乌贼神经肽LFRFamide，所述神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(open reading frame，ORF )567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’‑UTR)91bp，3’非编码区(3’‑UTR) 202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。

【技术特征摘要】
1.虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，其特征在于包括虎斑乌贼神经肽LFRFamide，所述神经肽LFRFamide基因cDNA全长860bp，开放阅读框(openreadingframe，ORF)567bp，编码188个氨基酸，5’非编码区(5’-UTR)91bp，3’非编码区(3’-UTR)202bp，前体蛋白相对分子质量(MW)为21.5kDa，等电点(pI)为9.40。2.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，其特征在于：所述的神经肽LFRFamide生殖调控制剂的制备方法包括总RNA提取、cDNA第一链的合成、虎斑乌贼LFRFamide核心序列的扩增、RACE获得LFRFamide基因cDNA的全长和序列信息分析。3.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，其特征在于：所述的总RNA提取步骤为取脑组织样品浸入Trizol，匀浆后静置，加入氯仿后剧烈震荡，静置后离心，取最上层上清液，加入异丙醇摇匀静置，离心后取沉淀，在沉淀中加入70~80%浓度的乙醇，用枪头吹吸沉淀，离心，用枪头吸除液体部分，保留的沉淀即为总RNA。4.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，其特征在于：所述的cDNA第一链的合成步骤为：利用从脑组织提取的总RNA进行反转录，合成cDNA第一链。5.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽LFRFamide生殖调控制剂，其特征在于：所述的虎斑乌贼LFRFamide核心序列的扩增步骤为：根据NCBI数据库中已报道的5种软体生物LFRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，设计简并引物来获得虎斑乌贼LFRFamide基因核心片段；利用已获得的核心片段序列设计5’RACE和3’RACE引物；克隆LFRFamide所需引物为：LFRFamide-F：CAAACGCAACAGCCTCTTCCG；LFRFamide-R：AGTGCGGCTTCGTCCATACC；5’-LFRFamide-outter：GCTGCGTTTTAGTCCTTCG；5’-LFRFamide-inner：TTCGGGGTCGTCCTTGCT；3’-LFRFamide-outte...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟长凤，李颖，孙连莲，曹子豪，吕振明，徐梅英，吴常文，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33