本发明专利技术涉及的是一种生物医药技术领域的定向积累杀念菌素单一组份ＦＲ－００８－Ⅲ（Ｃａｎｄｉｃｉｄｉｎ Ｄ）的基因工程菌株。在染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶ＦｓｃＦ上的功能域ＫＲ２１和位于聚酮合酶ＦｓｃＥ上的功能域ＤＨ１８的催化活性位点均发生了突变，ＫＲ２１突变为：第１５２６位酪氨酸（Ｙ）突变为苯丙氨酸（Ｆ）；ＤＨ１８突变为：第３０８４位组氨酸（Ｈ）突变为酪氨酸（Ｙ）以及第３０８３位天冬氨酸（Ｄ）突变为缬氨酸（Ｖ）。本发明专利技术定向生产杀念菌素单一组份ＦＲ－００８－Ⅲ，其产量是野生型菌株该组份产量的１２０－１３０％，而ＦＲ－００８－Ⅲ是杀念菌素３个主要组分中最具药用价值的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种生物医药
的菌株，特别是一种定向积累杀念 菌素单一组份FR-008-III (Candicidin D)的基因工程菌株。技术背景链霉菌属原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要的微生物类群之一。 很多聚酮类抗生素产生于这类细菌，并且己广泛应用于医用、兽用及农用，这包 括红霉素(抗菌)，制霉菌素(抗真菌)，阿维菌素(抗寄生的)和纳巴霉素(免 疫抑制剂)等。聚酮合酶(PKS)是可以催化合成一大类长度、功能基团和环化状态不同的 聚酮大环内酯类天然产物的多功能酶类。PKS催化模式类似于经典的脂肪酸合成 酶(FAS)的功能模式。聚酮合酶分为I型(Type I PKS)和II型(Type II PKS) 两类。大环内酯类化合物如杀念菌素、红霉素以及夹竹桃霉素等由I型聚酮合酶 负责合成。I型聚酮合酶体系由几个多功能酶组成，每个多功能酶都包含参与聚 酮生物合成过程所需的各种催化功能域，这包括酰基转移酶(AT)、酮基合成 酶(KS)、酰基载体蛋白(ACP)、酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)或烯醇还原酶(ER)。其中KS、 AT、 ACP是负责聚酮链延伸所必须的功能域，其余非必须的功 能域(KR、 DH、 ER)则负责聚酮链上功能基团(酮基，羟基，碳碳单键或双键) 的变化。由于每一功能域只参与整个聚酮碳链合成中的一步生化反应，这样聚酮 链的长短以及功能团的变化便取决于聚酮合酶上功能域的数量，种类及其排列组 合。II型聚酮合酶与I型聚酮合酶的差别仅在于前者的功能域在聚酮链延伸的 反应步骤中被重复使用。七烯大环内酯类抗生素杀念菌素(FR-008/Candicidin)由链霉菌FR-008(Str印tomyces sp. FR-008)产生，其合成机制已被阐明，属于典型的I型聚 酮合酶工作模式。文献报道七烯大环内酯类抗生素对真菌细胞膜中数量最大的固醇麦角固醇具有很大的亲和性，从而对真菌细胞具有选择性的毒性。杀念菌素是治疗人类严重系统性真菌感染最重要的抗生素之一。杀念菌素复合物的主要包含 三个组份FR-008-III (Candicidin D)、 FR-008-V和FR-008-VI，其中以 FR-008-III (Candicidin D)为主要活性组份。根据杀念菌素生物合成模型以及杀念菌素3个组份的结构差异，推测杀念 菌素生物合成过程中的两个催化功能域(KR21和DH18)的非完全活性可能导致 了杀念菌素3个组份的同时生成。通过在染色体上定点突变的方法使KR21和 DH18功能域失去催化活性，从而得到相应的突变株。对突变株发酵产物的高压 液相和质谱分析(LC-MS)结果印证了这一推论，即KR21功能域的突变失活导致 了 FR-008-V的丢失；DH18功能域的突变失活导致了 FR-008-VI的丢失；KR21和 DH18功能域均突变失活后，仅定向积累FR-008-III (Candicidin D)。
技术实现思路
本专利技术的目是获得能单一积累杀念菌素复合物中最具药用价值的定向积累 杀念菌素单一组份FR-008-ni的基因工程菌株，使得本专利技术可以大规模生产高 纯度的杀念菌素有效组份。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术在杀念菌素产生菌链霉菌 FR-008染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮 合酶FscF上的功能域KR21和位于聚酮合酶FscE上的功能域DH18的催化活性位 点均发生了突变，KR21突变为聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸突变为苯丙氨 酸；DH18突变为聚酮合酶FscE第3084位组氨酸突变为酪氨酸以及第3083位 天冬氨酸突变为缬氨酸。该基因改造所得到的工程菌株ZYJ-6仅生产杀念菌素活 性组份FR-008-111，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。该基因工程菌株的构建方法 (一)确定功能域KR21 (存在于聚酮合酶FscF)和DH18(存在于聚酮合酶 FscE)的催化活性位点。(二)设计并构建分别用于对KR21和DH18的催化活性位 点进行突变的同源重组载体pJTU573和pJTU572。(三)把pJTU573通过接合 转移导入菌链霉菌FR-008进行同源重组。(四)首先通过硫链丝菌素抗性影印筛 选，进而通过PCR以及对PCR产物酶切验证和测序验证的方法最终筛选到KR21突变株。(五)同样方法，把pJTU572导入KR21突变株进行同源重组，最终筛选 到KR21和DH18双突变株ZYJ-6。本专利技术定向生产杀念菌素单一组份FR-008-III,其产量是野生型菌株该组 份产量的120-130%，而FR-008-III是杀念菌素3个主要组分中最具药用价值 的成份。通过该工程菌可以大规模生产高纯度的杀念菌素有效组份，所以具有显 著的工业应用价值。本专利技术定向积累杀念菌素单一组份FR-008-III的基因工程菌株，其工程菌 ZYJ-6己提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏登记编号 为CGMCC NO. 2394，保藏期限为2008. 03. 07日起的30年。附图说明图1:突变株ZYJ-6和野生型菌株(链霉菌FR-008)之间的衍生关系。KR21 属于聚酮合酶FscF的一个功能域。聚酮合酶FscF第1526位酪氨酸(Y)突变为 苯丙氨酸(F)，从而导致功能域KR21活性位点发生了突变。DH18属于聚酮合 酶FscE的一个功能域。聚酮合酶FscF第3084位组氨酸(H)突变为酪氨酸(Y) 以及第3083位天冬氨酸(D)突变为缬氨酸(V)，从而导致功能域DH18活性位 点发生了突变。突变株ZYJ-6则包含了上述功能域KR21和DH18的双突变。星号 表示突变后的功能域。Apol和BsrGI分别代表突变后引入的限制性酶切位点。 方框内的碱基序列表示限制性酶识别序列。图2:突变株ZYJ-6和链霉菌FR-008野生型菌株发酵产物的HPLC (高压液 相)检测结果。V， III以及VI分别代表FR-008-V， FR-008-III和FR-008-VI。 ZYJ-6突变株仅生产FR-008-in，而不再积累原始组份FR-008-V和FR-008-VI。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的实施例作详细说明本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保 护范围不限于下述的实施例。实施例一通过先引入KR21突变后再引入DH18的突变从而获得双突变株 ZYJ-6(一)质粒的构建(用于导入宿主并和染色体发生同源重组以便获得目标突变)(1)用于KR21功能域突变的质粒构建EcoRI和Kpnl酶解链霉菌FR-008文库柯斯质粒pHZ220后回收3615-bp EcoRI-KpnI DNA片段作为PCR模板，引物Pl和P3用来扩增528-bp DNA片段； P4和P2用来扩增618-bp DNA片段。P3和P4有18-bp的重叠，在该重叠区域引 入突变位点(Y1526F),同时引入DNA限制性酶切位点(ApoI)以便该突变的筛 选(如图l所示)。通过第二次PCR (引物为P1和P2;模板为琼脂糖胶回收后的 两个PCR产物各取1/100加入PCR体系)得到1146-bp DNA片段。1146-b本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定向积累杀念菌素单一组份ＦＲ－００８－Ⅲ的基因工程菌株，其特征在于，在杀念菌素产生菌链霉菌ＦＲ－００８染色体上引入基因突变，从而导致杀念菌素生物合成途径中的位于聚酮合酶ＦｓｃＦ上的功能域ＫＲ２１和位于聚酮合酶ＦｓｃＥ上的功能域ＤＨ１８的催化活性位点均发生了突变，所述的菌种保藏编号为ＣＧＭＣＣ ＮＯ：２３９４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓子新，周永军，白林泉，由德林，李家良，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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