一种抗病、高产棉花的育种方法及应用技术

本发明专利技术是利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，采用拌种、灌根和注射不同处理方式的组合技术，获得抗病、高产棉花及后代，经菌落形态、１６Ｓ　ｒＤＮＡ和抗菌蛋白基因片段的核苷酸序列鉴定，其根、茎、叶和种子中内生有抗病芽孢杆菌，直接应用于棉花生产后，黄萎病病情指数５－３０，产量增幅１５％－４０％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，获得抗病、高产棉花的育种方法。获得的 抗病、高产棉花及后代的根、茎、叶和种子中内生有抗病芽孢杆菌，能直接应用于棉花生产， 解决棉花抗病问题。技术背景在自然界中，植物与各种各样的微生物共处于一个生态环境。植物不仅与病原菌存在紧密 的相互作用，同时和它周围的其他非致病菌也存在着一定的联系。长期以来，为了防治植物 病害，人们大量使用化学农药，造成病原物的抗药性不断增强。随着人们环保意识的不断增 强，植物病害生物防治，特别是生物农药的研究和应用受到各国政府和民众的高度重视。生 物防治具有无污染、无公害、长效性等优点，逐渐成为植物病害综合治理中的重要组成部分。 枯草芽孢杆菌是一种自然界广泛存在、对人畜无毒无害、不污染环境、对植物病害有抑制作 用的非致病细菌，同时还是植物体内常见的内生细菌。枯草芽孢杆菌突出的特点是，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产、剂型加工 及在环境中存活、定殖与繁殖。它还可以产生丰富的抗菌物质，是植物病害生物防治微生物 的重要组成部分。枯草芽孢杆菌防病机制主要包括其分泌的抗菌物质具有抗生作用，和致病 菌在空间和营养上的竞争，对寄主植物抗性的诱导作用和促生作用等。利用枯草芽孢杆菌防 治植物病害是目前植物病害生物防治研究的热点。美国已有四株枯草芽孢杆菌经环保局(EPA) 批准进入商品化或有限商品化应用，如GB03， MBI600， QST713禾tl FZB24;日本的RB14 和NB22;澳大利亚的A-13和我国自主开发的B-916， B-3， B-908等。我国也在利用枯草芽 孢杆菌防治棉花黄萎病菌方面进行了探索。李社增等研究了防治棉花黄萎病的生防细菌 NCD-2，经过鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌(万flciZtos"to'fc)(李社增等，2005)。曹君等研究 了枯草芽孢杆菌和哈茨木霉协同作用对棉花黄萎病菌防治(曹君等，2005)。 Tehrani等从土 壤中分离到5株抗棉花黄萎病菌的高效菌株2020、 3、 204、 202、 309，.经鉴定2020 、 3为 假单胞杆菌，204 、 202、 309为芽孢杆菌；制成菌剂应用于大田试验，证明这5株菌株不仅 对棉花黄萎病菌有拮抗作用，而且能不同程度地提高棉花的产量(Tehrani等，2001)。利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究主要是利用其活体菌来防治植物病害，作为活体菌，其本身也存在许多限制因子，例如生态适应性、环境的抗逆性等。在一生态系统中引入生防 菌，它能否适应其被引入的生态环境，能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及与相应病原 物竞争是能否成功防治病害的关键。这些都与生防菌的生物学特性紧密相关。理想的生防菌 应具有营养竞争能力强，抗菌物质产量高，生长速度快及适应性强等特点，竞争和定殖是细 菌在植物促生和防病作用过程中的推动力，也是成功的关键。因此，具有强活力的枯草芽孢 杆菌能否在植株上定殖是其能否发挥生防活性的关键因素。迄今为止，己报道的枯草芽孢杆菌类生物农药产品基本都是芽孢制剂，还没有见到将枯草 芽孢杆菌抗菌代谢产物直接加工成生物农药产品的报道或利用枯草芽孢杆菌内生性使植株后代携带菌体，从而获得具有抗病能力的种质资源。虽然科研人员针对棉花黄萎病生物防治 做了大量的研究工作，但生物防治效果不够稳定，仍没有一种成功应用于大批量生产和推广 的拮抗微生物。目前已有防治其他作物黄萎病的生防制剂商品，但登记注册的防治棉花黄萎 病的生防菌还未见报道。本专利技术采用的抗病枯草芽孢杆菌能够分泌抗多种植物致病真菌和细菌的抗菌物质。同时枯 草芽孢杆菌的作为常见内生菌，在植物中具有较强的定殖能力的特性。利用具有拮抗作用的 枯草芽孢杆菌Blll，采用拌种、灌根和注射的方法使其定殖的棉花中，提高棉花的抗病能力， 最终获得能直接应用于生产的抗病、高产的棉花品种及后代，解决棉花抗病问题
技术实现思路
本专利技术提供一种利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，培育抗病、高产棉花的育种方法，其特征 在于(1) 处理方法A——拌种用芽孢悬液浸泡棉花种子。(2) 处理方法B"^灌根棉株发芽后用芽孢悬液灌根。(3) 处理方法C——注射用芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。(4) 处理方法D——拌种结合灌根用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液 灌根。(5) 处理方法E——拌种，灌根结合注射用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢 悬液灌根，芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。本专利技术中所述的抗病芽孢杆菌中，其中的一种是指抗棉花枯萎病、黄萎病菌的枯草芽孢杆 菌Blll (分类命名5fl"7/M Wto7&，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心；地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号CGMMCC No.l497;保藏日期2005年10月18日)。本专利技术还提供一种棉花根、茎、叶和种子中内生有枯草芽孢杆菌的鉴定方法，其特征在于棉花的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落，需同时满足以下两个条件，具体步骤如下(1) 菌落形态检测菌株细胞杆状，产生芽孢，中生，营养琼脂培养基上菌落无光泽、粗 糙、边缘不整齐、凸起，菌落呈褶皱状。革兰氏染色、过氧化氢酶反应和V-P反应呈 阳性。能利用葡萄糖、甘露糖，木糖醇，利用葡萄糖不产气，利用半乳糖不产酸，能 水解明胶、酪素。(2) 16S rDNA序列测定从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的菌落形态符合(1)中 菌落形态特征的单菌落，菌落培养液经引物27f: 5'-gagagtttgatcatggctcag-3'和1541R: 5' "Cgggatccaaggaggtgatccagcc-3'，PCR扩增获得的1479bp核酸片段序列，与序列表中SEQ IDNO:l有97%以上的同源性。本专利技术另外还提供一种棉花的根、茎、叶和种子中内生有枯草芽孢杆菌Blll的鉴定方法， 其特征在于棉株的根、茎、叶和种子中分离出的单菌落，除满足以上鉴定棉株中内生有枯草 芽孢杆菌的两个条件以外，同时满足以下条件(1)利用枯草芽孢杆菌B111的抗菌蛋白基因 6"核酸片段序列进行鉴定从棉花的根、茎、叶和种子中，分离出的单菌落培养液，利用引物Fl : 5'陽acggtctcattaaataattcttctgaa-3，， Rl: 5'隱aegatagtaaatctgctccgcttt-3', 以菌体基因纟且DNA 为模板进行PCR扩增，获得729bp核酸片段序列完全符合序列表中SEQ ID NO:2。 采用本专利技术所述的利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，经不同处理方式的组合技术，选育出的 抗病、高产棉花及后代，经菌落形态、16SrDNA和抗菌蛋白基因片段的核苷酸序列鉴定，其 根、茎、叶和种子中内生有抗病芽孢杆菌，直接应用于生产后，黄萎病病情指数5-30，产量 增幅15%-40%。本专利技术提供的抗病、高产棉花的育种技术和棉花根、茎、叶和种子中内生抗 病芽孢杆菌的鉴定方法，还可以应用于其它单子叶植物和双子叶植物，以获得抗病、高产植 物。附图表说明图l:从处理后棉花中分离的内生菌菌落与枯草芽孢杆菌Blll的形态比较，(A)为从处理后棉花中分离的内生菌，(B)为枯草芽孢杆菌Blll。图2:从棉花中分离的内生菌菌落的1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用抗病芽孢杆菌作为内生菌，培育抗病、高产棉花的育种方法，其特征在于：（１）处理方法Ａ－拌种：用芽孢悬液浸泡棉花种子。　（２）处理方法Ｂ－灌根：棉株发芽后用芽孢悬液灌根。　（３）处理方法Ｃ－注射：用芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。　 　（４）处理方法Ｄ－拌种结合灌根：用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液灌根。　（５）处理方法Ｅ－拌种，灌根结合注射：用芽孢悬液浸泡棉花的种子，棉株发芽后用芽孢悬液灌根，芽孢悬液注射棉株茎基或果实幼体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭三堆，白玮，张锐，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，郭三堆，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]