检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子技术

本发明专利技术涉及检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子及其组合。此外，本发明专利技术还涉及用于鉴别和／或鉴定和／或确定与酿造有关的微生物的属或种的核酸分子及其组合的使用方法。为此，本发明专利技术目的在于提供检测啤酒及其酿造原料的微生物污染的最快速的方法和手段。此测试应包括鉴别所有可致啤酒污染的微生物。本发明专利技术通过以下步骤完成上述任务：（ａ）将样品与至少包括两个核酸分子（引物）的组合接触，此核酸分子与和酿造有关的微生物核酸的一个保守区域杂交；（ｂ）扩增微生物的核酸分子或其一部分，以产生至少一个扩增片段。（ｃ）将在步骤（ｂ）中获得的扩增片段与至少一个二级的核酸分子（探针）接触，上述二级核酸分子与至少一个扩增片段进行杂交，这个扩增片段包括一个对于所有与酿造有关的微生物的，或对于一个或多个与酿造有关的微生物的科、属、种的微生物核苷酸的特异的片段；（ｄ）鉴别至少一个由扩增片段和从ｃ）中得出的二级核酸分子共同构成的杂交核酸分子。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子及其组合。此外，本专利技术还涉及用于鉴别和/或鉴定和/或确定与酿造有关的微生物的属或种的核酸分子及其组合的使用方法。
技术介绍
啤酒从微生物学角度看是非常稳定的，只有相对少的细菌可使啤酒腐败。为了能尽早发现导致污染的菌体，需使用一种快速鉴别啤酒中的细菌的方法，以便尽快采取相应措施。所有使啤酒腐败的菌体的共同特点在于它们在单个容器中(啤酒桶，啤酒瓶)的污染微量，并且生长缓慢。厌氧菌的微生物培养尤其困难。目前熟知的可使啤酒变坏的细菌被归类为以下菌属乳酸杆菌(Lactobacillus)，片球菌(Pediococcus)，梳状菌(Pectinatus)，大孢菌(Megasphaera)。硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)中的代表作为可使啤酒腐败的细菌虽然还未显现，但是不能排除其污染啤酒和在其中生长的可能。乳酸杆菌属(Lactobacillus)为革兰氏阳性的、不产生孢子的、大多不运动的、链状的、细长的、有时弯曲的杆菌。有时也可发现其球状的形态。其代表物为微嗜氧的，部分是厌氧的。它们为细胞色素酶和分解酶阴性，需要复杂的营养条件。其代谢为发酵型。DNA的G+C含量为32-53％。除了啤酒，乳酸杆菌还可存在于奶制品、谷物制品、肉和鱼类制品、水、废水、葡萄酒、水果和果汁、腌制蔬菜、酸菜、青贮饲料和发酵面团中。它们虽存在于哺乳动物的口、肠、阴道内，但却很少致病(Bergeys，Manual of Syst.Microbiology，1984，S.1209-1234)。这些细菌通过它们的代谢产物使啤酒浑浊或出现异味。可使啤酒变质的菌种包括Lactobacillus brevis，Lactobacillus lindnereri，Lactobacilluscasei，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus coryniformis和Lactobacilluscurvatus(Back，Brauwert，1980，120，S.1562-1569)。片球菌属(Pediococcus)包括革兰氏阳性的、不运动并不产生孢子的球菌。它们形成四联体或二联体。它们选择性厌氧，种与种之间对氧气的敏感度不同。片球菌(Pediococcus)为细胞色素氧化酶和分解酶阴性，需要复杂的营养条件(Bergeys Manual of Syst.Microbiology，1984，S.1075-1079)。它们被用于生香肠的生产，发酵多种腌菜并可导致食品变质(Firnhaber，BaumgartMikrobiologsche Untersuchung vonLebensmitteln，1993，S.413-419，115-117)。片球菌属(Pediococcus)包括八个种，其中Pediococcus damnosus和Pediococcus inopinatus这两种可使啤酒变质。梳状菌属(Pectinatus)包括Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatusfrisingiensis和在分类学上亲缘关系不远的种Pectinatus sp.DSM20764。所有的种都已从变质的啤酒中发现(Schleifer et al.Int.J.of Syst.Bacteriology，1990，S.19-27)。它们是略微弯曲的、不产生孢子的杆菌。它们呈梳状排列并且是运动的。它们既不产生分解酶，也不产生细胞色素氧化酶，并专性厌氧。分子G+C占38-41％。梳状菌属(Pectinatus)及大孢菌属(Megasphaera)，硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)的细胞壁均为革兰氏阳性。尽管其革兰氏染色为阴性，但它们在分类学上被归入革兰氏阳性菌(Haikara，the Prokaryotes，第2版，卷II，1991，S.1993-2004)。大孢菌属(Megasphaera)包括Megasphaera elsdenii和Megasphaeracerevisiae。只有Megasphaera cerevisiae与酿造有关，是革兰氏阴性的、严格厌氧的、细胞色素氧化酶和分解酶阴性的、不运动的、部分轻微伸展的球菌。它们以单个、成对或短链的形式存在。平均的细胞直径为1.4μm，分子G+C占41.4-44.8％。主要代谢产物为与硫有关的物质，如H2S和挥发性脂肪酸。Megasphaera cerevisiae的污染可改变啤酒的气味和口味(Haikara，the Prokaryotes，第2版，卷II，1991，S.1993-2004)。硒单胞菌属(Selenomonas)的菌种是专性厌氧、革兰氏阴性的、不产生孢子的、略微弯曲并运动的杆菌。分子G+C占48-58％(Schleifer et al.Int.J.of Syst.Bacteriology，1990，S.19-27)。硒单胞菌属(Selenomonas)存在于哺乳动物的胃、肠和粪便中。它包括10个菌种(Hespell et al.，The Prokaryotes，第2版，卷II，1991，S.2005-2013)。只有Selenomonaslacticifex存在于起始酵母中，因而它与酿造有关。虽然，Selenomonaslacticifex不被视为引起啤酒腐败的细菌，但其可能在啤酒中繁殖，从而仍被认为是引起啤酒变质的细菌。嗜酶菌属(Zymophilus)包括Zymophilus paucivorans和Zymophilusraffinosivorans。它们为革兰氏阴性、运动的、轻微弯曲的杆菌。它们以单个、成对或短链的形式存在。分子G+C占38-41％。它们专性厌氧，并导致发酵代谢。上述的两种嗜酶菌种存在于起始酵母和酿酒厂的废物中。只有Zymophilus raffinosivorans在啤酒中繁殖(Schleifer et al.Int.J.of Syst.Bacteriology，1990，S.19-27)。基于16S-rDNA基因序列的比较，所有待检的菌属都被归于G+C含量低的革兰氏阳性菌。片球菌属(Pediococcus)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)被归于乳酸杆菌科(Lactobacillacace)。梳状菌属(Pectinatus)，大孢菌属(Megasphaera)，硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)被归于粘孢菌组(Sporomusa)。粘孢菌组(Sporomusa)被视为带革兰氏阴性细胞壁的革兰氏阳性菌(Stackebrndt et al.，TheProkaryotes，第2版，卷II，1991，S.25-26，33)。用传统的微生物学方法鉴别上述细菌需要可能多达10天的时间，因此，人们需要一种更快捷的检测方法，否则会产生不必要的仓储费用或出现被检测啤酒在检测结果得出之前即已出厂的情形。为此，人们专利技术了很多快速检测方法，例如检测致啤酒变质的细菌的代谢产物的方法(Haikara et al.，Microbiology，1995，141，S本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测样品中与酿造有关的微生物的方法。该方法包括下列步骤：（ａ） 将样品与至少包括两个一级核酸分子（引物）的组合接触。此核酸分子与和酿造有关的微生物核酸的一个保守区域杂交；（ｂ） 扩增微生物核酸分子或其一部分，以产生至少一个扩增片段； （ｃ） 将在步骤（ｂ）中获得的扩增片段与至少一个二级的核酸分子（探针）接触，上述二级核酸分子与至少一个扩增片段进行杂交，这个扩增片段包括一个对于所有与酿造有关的微生物的，或对于一个或多个与酿造有关的微生物的科、属、种的微生物核苷酸的特异 的片段；（ｄ） 鉴别至少一个由扩增片段和从ｃ）中得出的二级核酸分子共同构成的杂交核酸分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：马库斯范德克，亚力克山大加什，克纳利亚柏克豪夫，
申请(专利权)人：生物技术检测公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]