一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法制造技术

本发明专利技术是关于采用氨偶联酶法，应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制测定试剂，用于测定体液样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的酶法测定试剂。本发明专利技术所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶－底物－ＮＡＤ或酶－底物－ＮＡＤＰ等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，本发明专利技术所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法。腺苷脱氨酶的活性测定方法主要包括放射核素法、电泳法和生化法。放射核素法灵敏度高，但需使用放射性核素，操作复杂，费用高，限制了该方法的临床应用，电泳法多用于腺苷脱氨酶同工酶的活性测定，由于电泳法测定时间较长，操作繁琐，不宜自动化，难以对大量样本进行测定，因此，临床上大多采用生化法。在生化法中，主要包括氨偶联酶测定法和次黄苷生成率测定法。次黄苷生成率测定法是于250nm波长处直接测定腺苷脱氨酶分解腺苷产生的次黄嘌呤核苷，由于其吸收峰与腺苷吸收峰部分重合，故灵敏度低，准确度差。氨偶联酶测定法是通过偶联的谷氨酸脱氢酶测定腺苷脱氨酶分解腺苷产生的氨。在传统的试剂配制过程中，需要加入氢氧化钠并煮沸去氨，以提高测定的准确度。在保存过程中，试剂容易发生生环境中氨污染，降低试剂的测定性能。本专利技术采用内源性慢反应酶循环机制不断排除试剂中污染的氨，从而无需煮沸去氨，并在试剂保存过程中，该机制能不间断地排除氨污染，稳定和提高了试剂的测定性能。在腺苷脱氨酶及其同工酶活力的氨偶联酶测定法中，采用还原型烟酰胺辅酶或其类似物(如NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH)测定体液样本中的腺苷脱氨酶及其同工酶是一个较为常用的方法，试剂中还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化程度，与样本中被测物的浓度成正比。根据样本中腺苷脱氨酶及其同工酶的活力，采用相应的酶反应机制，经过酶与底物反应，试剂中还原型烟酰胺辅酶或其类似物被氧化，反应系统的吸光度发生变化，通过测定反应系统的吸光度变化值，就可计算出样本中腺苷脱氨酶及其同工酶的浓度。血清、血浆或体液样本中总腺苷脱氨酶活力的测定样本中总腺苷脱氨酶分解腺苷产生的次黄嘌呤核苷和氨，氨在谷氨酸脱氨酶作用下与a-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADH或NADPH被氧化为NAD+或NADP+，反应系统在340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中总腺苷氨酶的活力。血清、血浆或体液样本中腺苷脱氨酶同工酶活力的测定原理与测定总腺苷脱氨酶活力的方法相同，在测定腺苷脱氨酶同工酶活力时，通过在试剂中加入腺苷脱氨酶同工酶1和腺苷脱氨酶同工酶1+cp的强抑制剂，如红-9-(2-羟基-3-壬烷)烷腺嘌呤(EHNA)，再测定腺苷脱氨酶同工酶2的活力。总腺苷脱氨酶的活性减去腺苷脱氨酶同工酶2的活性即为腺苷脱氨酶同工酶1和腺苷脱氨酶同工酶同工酶1+cp的活性。但是由于试剂制造过程和环境中大量的氨污染，以及还原型烟酰胺辅酶或其类似物，特别是NADH和NADPH在这类酶试剂中不稳定，实际应用中只能采用干粉或冻干试剂。干粉或冻干试剂通过保持试剂的干燥状态，试剂的水分含量一般低于20％，以保持NADH或NADPH的稳定，试剂在复溶时采用煮沸去氨的复溶水，复溶后需立刻测定。还原型烟酰胺辅酶在液体试剂的应用中，Joseph De Giorgio等(参见美国专利5804402和5705356)专利技术了在测定试剂中加入NADH或NADPH的稳定酶系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其非专一性底物葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而达到排除氨污染，保持测定试剂中有效还原型烟酰胺辅酶浓度的目的。在他们的专利技术中，测定试剂生产或配制时不加入反应产物NAD或NADP，仍然按照传统的试剂生产或配制方法，加入NADH或NADPH，嵌入的再生酶系统仅仅用于NADH或NADPH氧化后的单向再生，并不生成新的NADH或NADPH。此外，这一专利技术中，Joseph De Giorgio等也未提出利用反应产物生产测定试剂的方法；也未提出测定腺苷脱氨酶的试剂。Richard A.Kaufman等(参见美国专利5589348)利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖-6-磷酸，在试剂测定过程中原位同时或先于测定样本快速生成还原型辅酶，用于被测物的测定。在他们的专利技术中，还原型烟酰胺辅酶的生成速率必需大于被测物酶系统再氧化的速率。被测物测定是在生成还原型辅酶的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖-6-磷酸的摩尔浓度必须低于用于生成还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此这类测定试剂配制成反应试剂后，生成的NADH或NADPH与普通测定试剂中一样不稳定，试剂保存过程中同样不能排除氨污染。在他们的专利技术中，相对于被测物酶系统将还原后的辅酶再氧化的速率，生成还原型辅酶的速率不可能以绝对快的速率完成，因此，测定样本中被测物含量时需要测定已知浓度的标准样本进行对照计算，从而求出样本中被测物的含量。采用这一方法在实际应用中很难对体液样本中的酶含量进行测定。本专利技术是在测定试剂生产或配制时加入辅酶或其类似物的反应产物，如NAD、NADP、thioNAD或thioNADP，及其慢反应酶和底物，形成慢反应酶-底物-NAD、酶-底物-thioNAD、酶-底物-NADP或酶-底物-thioNADP等系统。测定试剂中有效的NADH、thio-NADH、NADPH或thio-NADPH含量是由该系统生成的同时该系统由于不断生成测定所需的还原型辅酶或其类似物，从而大大提高了试剂的稳定性，测定试剂配制完成后及保存过程中，内部嵌入的慢反应酶系统能不断排除试剂内和环境中的氨污染，提高试剂测定的准确度。本专利技术同时首次提出了一种利用反应产物逆向生成原反应物的测定腺苷脱氨酶及其同工酶的试剂生产方法。本专利技术同时公开了一种节约和改良的测定腺苷脱氨酶及其同工酶试剂的配制和生产方法，由于试剂生产配制时不使用NADH、NADPH、thio-NADPH或其类似物，从而大降低了试剂的原料成本。本专利技术同时公开了一种改良的测定腺苷脱氨酶及其同工酶的试剂，该试剂能不断地排除试剂内和环境中发生的氨污染。根据本专利技术的原理，试剂测定中可以采用的还原型辅酶或其类似物的生成系统很多，包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等。为了有效地降低还原型烟酰胺辅酶或其类似物的生成速率，不影响试剂的测定性能，可以对上述生成系统中的酶和底物及其浓度进行高速使其生成还原型烟酰胺辅酶或其类仿物的速率在测定被测物时不影响还原型烟酰胺辅酶或其类似物的氧化速率。例如，葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶-甘油-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统等。考虑到测定样本时样本中可能含有的底物物质影响到还原型烟酰胺辅酶或其类似物的生成速率，进而影响被测物的测定反应，上述各系统中优先选用的系统为甘油脱氢酶-乙二醇-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统和(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统，最为优先选用的系统为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统。以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定腺苷脱氨酶的试剂，其特征在于：采用氨偶联酶法，应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制测定试剂，包含其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，在试剂内形成酶－底物－ＮＡＤ、酶－底物－（ｔｈｉｏ－ＮＡＤ）、酶－底物－ＮＡＤＰ或酶－底物－（ｔｈｉｏ－ＮＡＤＰ）慢反应系统。如：葡萄糖脱氢酶－木糖－氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、乳酸脱氢酶－ａ－酮戊二酸－氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、甘油脱氢酶－乙二醇－氧化型烟酰胺辅酶或其类似物系统、（葡萄糖－６－磷酸脱氢酶）－葡萄糖－氧化型烟酰胺辅酶。如：ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ｔｈｉｏ－ＮＡＤＨ或ｔｈｉｏ－ＮＡＤＰＨ等，对体液样本中腺甘脱氨酶及其同工酶活力进行测定的酶法测定试剂。葡萄糖－６－磷酸脱氢酶－葡萄糖－氧化型烟酰胺辅酶或其类似物酶反应系统生成有效的ＮＡＤＨ或其类似物浓度的速率在０．００１－３６５天之内，最好在１－７天之内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜箫，
申请(专利权)人：江西特康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]