单一稳定烟酰胺辅酶液体试剂的制备方法技术

本发明专利技术是关于应用还原型烟酰胺辅酶（ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ）测定体液样本中被测物的酶法测定试剂，本发明专利技术所指的酶法测定试剂是加入氧化型烟酰胺辅酶以及与之相应的酶和底物系统，将氧化型辅酶缓慢徨还原为还原型烟酰胺辅酶，当被还原的还原型烟酰胺辅酶达到一定的浓度时，本发明专利技术所指的酶法试剂就可达到测定被测物的目的。这类试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。该系统由于不断生成测定所需的ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ，从而大大提高了试剂的稳定性，并大大降低试剂的生产成本。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及采用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定试剂及其制法。
技术介绍
采用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定体液样本中的被测物是一个广泛使用的方法，试剂中NADH或NADPH的氧化程度，与样本中被测物的浓度成正比。根据样本中不同的被测物，采用相应的酶反应机制，经过酶与底物反应，试剂中NADH或NADPH被氧化，反应系统的吸光度发生变化，通过测定反应系统的吸光度变化值，就可计算出来本中被测物的浓度。例如血浆样本中氨浓度的测定，血浆中的氨在谷氨酸脱氨酶作用下与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸盐，同时NADPH被氧化为NADP+，反应系统在340nm处的吸光度值下降，通过测定340nm处吸光度的下降值。就可以算出样本中氨的浓度。 再例如血清样本中丙氨酸氨基转移酶浓度的测定，样本中丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸；生成的丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶还原为L-乳酸，同时NADH被氧化为NAD，反应系统在340nm处的吸光度值下降。通过测定340nm处吸光度的下降值，就可以计算出样本中丙氨酸氨基转移酶的浓度。L-丙按酸+α-氨代戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH→L-乳酸+NAD+但是由于NADH或NADPH在这类酶试剂中不稳定，实际应用中多采用干粉试剂或液体双试剂。干粉试剂通过保持试剂的干燥状态，试剂的水分含量一般低于20％，保持NADH或NADPH的稳定；液体双试剂通过调整含有NADH或NADPH试剂部分的PH值，这部分试剂PH值一般在7.5-11.5之间，保持NADH或NADP的稳定。NADH或NADPH在液体单一试剂的应用中，Joseph De Giorgio等(参见美国专利5804402和5705356)专利技术了在测定试剂中加入NADH或NADPH的再生酶系统，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其非专一性底物葡萄糖，将试剂保存过程中NADH或NADPH，被氧化生成的NAD或NADP再缓慢还原为NADH或NADPH，从而保持测定试剂中有效的NADH或NADPH浓度。在他们的专利中，测定试剂生产或配制时不加入NAD或NADP，仍然按照传统的试剂生产或配制方法，加入NADH或NADPH，嵌入的再生酶系统仅仅用于NADH或NADPH氧化后的单向再生，并不生成新的NADH或NADPH。Richard A，Kaufman等(参见美国专利5589438)利用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其专一性底物葡萄糖-6-磷酸，在试剂测定过程中原位快速生成还原型辅酶，用于被测物的测定，其生成的速率需要大于被被测物酶系统再氧化的速率。被测物的测定是在生成还原型辅酶的同时或以后进行的，试剂中葡萄糖-6-磷酸的摩尔浓度低于用于生成还原型辅酶的氧化型辅酶的摩尔浓度，因此测定试剂配制成单一液体试剂后，生成的NADH或NADPH与普通测定试剂中一样不稳定。该方法多用于液体双试剂。在他们的专利中，相对于被测物酶系统将还原后的辅酶再氧化的速率，生成还原型辅酶的速率不可能以绝对快的速率完成，因此，测定样本中被测物含量时需要测定已知浓度的标准样本进行对照计算，从而求出样本中被测物的含量。采用这一方法在实际应用中很难对体液样本中的酶含量进行测定。
技术实现思路
本专利技术的在目的在于提供一种稳定性好，成本低的烟酰胺辅酶试剂及其制法。本专利技术的测定试剂生产或配制时加入酶-底物-NAD或酶-底物-NADP系统，测定试剂中有效的NADH或NADPH含量是由该系统生成的。本专利技术应用还原型烟酰胺辅酶(NADH或NADPH)测定体液样本中被测物的酶法测定试剂，其特点是在生产或配制过程中，本专利技术所指的酶法测定试剂不加入该还原型烟酰胺辅酶，而是加入氧化型烟酰胺辅酶(NAD或NADP)，通过试剂内内嵌的酶-底物-NAD或酶-底物-NADP系统缓慢循环将氧化型辅酶还原为还原型烟酰胺辅酶，当被还原的还原型烟酰胺辅酶达到一定的浓度时，本专利技术所指的酶法试剂就可应用于测定被测物的浓度。由于内嵌的酶和底物系统还原NAD或NADP的速率显著低于被测物及其测定酶或底物系统对NADH或NADPH的氧化速率，因此该内嵌的酶和底物系统不影响被测物的测定反应。本专利技术同时公开了一种节约和改良的测定试剂配制和生产方法，由于试剂生产配制时不使用NADH或NADPH，从而大大降低了试剂的原料成本。采用这一生产方法配制的试剂包括丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。本专利技术同时公开了一种改良的测定试剂，这类试剂包括丙氨酸氨基转酶试剂、天门冬氨酸氨基转酶试剂、尿素试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等。试剂测定中可采用的NADH和NADPH的生成系统，包括葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-NAD系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-NAD系统、甘油脱氢酶-甘油-NAD系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NADP系统等。为了有效地降低NADH或NADPH的生成速率。不影响试剂的测定性能，可以对上述生成系统中的底物浓度进行调整，使其生成(还原)NADHA或NADPH的速率在测定被测物时不影响NADH或NADPH的氧化速率。例如，葡萄糖脱氢酶-葡萄糖-NAD系统可调整为乳酸脱氢酶-葡萄糖脱氢酶-木糖-NAD系统、乳酸脱氢酶-丙酮酸-NAD系统可调整为乳酸脱氢脱氢酶-α-酮戊二酸-NAD系统、甘油脱氢酶-甘油-NAD系统可调整为甘油脱氢酶-乙二醇-NAD系统、以及(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NADP系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-(葡萄糖-6-磷酸)-NADP系统可调整为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NADP系统等。考虑到测定样本时样本中可能含有的底物物质影响到NADH或NADPH的生成速率，进而影响被测物的测定反应，上述各系统中优选用的系统为(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NAD或(葡萄糖-磷酸脱氢酶)-葡萄糖-NADP系统。本专利技术中的还原型辅酶生成系统生成的还原型辅酶在达到一定的浓度后，即可与试剂其它测定成份一起进行被测物的浓度测定，此时还原型辅酶生成系统可以已经完全成了还原型辅酶的生成反应，也可以仍在继续生成还原型辅酶。这一特点保证了采用本专利技术可以配制或生产出单一稳定的液体试剂。本专利技术中还原型辅酶生成系统生成还原型辅酶的速率可以是任何不干扰测定反应的速率，可以采用的生成有效NADH或NADPH浓度的速率在0.01-365天内之间，生成的还原型辅酶的吸光度在0.5-5.0范围之内，波长340nm，光径10mm；生成速率小于0.01天，生成系统会影响测定系统的测定性能，生成速率大于365天，测定试剂的配制非常困难。更为合适的生成速率是在1-30天之内，生成的还原型辅酶的吸光度为0.8-3.0，波长340nm，光径10mm，优先采用的生成速率是在1-7天内，生成的还原型辅酶的吸光度为1.1-2.5，波长340nm，光径10mm。葡萄糖-6-磷脱氢酶的浓度范围在1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟酰胺辅酶试剂，其特征在于：嵌入酶－底物－ＮＡＤ或酶－底物－ＮＡＤＰ，缓慢生成ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ的酶反应系统，并利用生成的ＮＡＤＨ或ＮＡＤＰＨ对体液样本中被测物浓度进行测定的酶法测定试剂，还原型辅酶生成系统可以结合测定试剂，加入缓冲液、防腐剂、重金属络合剂、表面活性剂和酶稳定剂，缓冲液包括Ｔｒｉｓ缓冲液、咪唑缓冲液、二乙醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、Ｇｏｏｄ’ｓ缓冲液，缓冲液的浓度一般选择在１０－２００ｍＭ范围之内，采用的防腐剂为叠氮钠，重金属络合剂包括ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＨＥＤＴＡ，酶稳定剂采用牛血清白蛋白，甘露糖醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜箫，
申请(专利权)人：江西特康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]