本发明专利技术公开了属于生物细菌的检测技术范围的一种用含３－氨基苯酚硼酸的纸片检测细菌ＡｍｐＣ酶的方法。主要是利用硼酸能抑制ＡｍｐＣ酶的原理，先配制ＡＰＢ溶液，并在不加３－氨基苯酚硼酸（ＡＰＢ）的ＣＡＺ，ＣＴＸ和ＦＯＸ纸片上添加ＡＰＢ，采用ＡＰＢ纸片增强法进行纸片法药敏实验，检测细菌产生的ＡｍｐＣ酶。ＡＰＢ可使ＣＡＺ或／和ＣＴＸ或／和ＦＯＸ纸片对产生ＡｍｐＣ酶细菌的抑菌环扩大，因此通过测定对产生ＡｍｐＣ酶细菌抑菌环直径改变来判断ＡｍｐＣ酶的存在，避免使用单一底物可能带来的漏检，提高检测的阳性率。该方法具有操作简单，成本低廉，结果判读清晰，重复性好，不需要特殊实验条件的优点，易于在临床实验室推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物细菌的检测技术范围，特别涉及一种用含3-氨基苯酚硼酸(APB)的纸片检测细菌AmpC酶的方法。
技术介绍
AmpCβ内酰胺酶，属于Ambler分类的C类酶(以下简称AmpC酶)是部分细菌如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等在生长过程中产生的一种能水解三代头孢类抗生素(如头孢他啶CAZ、头孢噻肟CTX、头孢曲松CRO)、头霉素(如头孢西丁FOX)、单胺类抗生素(如氨曲南AZT)的酶。产生AmpC酶的细菌对以上抗生素表现耐药性，当这些细菌引起感染(如败血症、肺炎、肾盂肾炎或伤口感染)时，采用以上抗生素将会使治疗失败。因此，正确检测产生AmpC酶的细菌，对于了解细菌耐药机制、指导临床合理选用抗生素具有重要意义。但目前为止，尚缺乏简单、有效的方法供临床实验室用于对产生AmpC酶的细菌进行常规检测。三维试验检测AmpC酶(Coudron PE，Moland ES，Thomson KS.Occurrence and detectionof AmpC beta-lactamases among Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，and proteus mirabilis isolates at a veterans medical center.J ClinMicrobiol，2000，381791-1796)，需要制备酶的粗提物，并在琼脂平板上挖槽，操作烦琐，费时，且需要特殊设备如超声破碎仪或反复冻融条件。最新国外介绍的Tris-EDTA检测AmpC酶的方法(Black JA，Moland ES，and Thomson KS.AmpCdisk test for detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamases inEnterobacteriaceae lacking chromosomal AmpC β-lactamases.J ClinMicrobiol，2005，433110-3113)虽然具有操作简单，成本低廉的特点，但需要制备含有Tris-EDTA及待检菌的纸片，增加操作步骤，且部分细菌的结果判读需要一定的经验。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用含3-氨基苯酚硼酸的纸片检测细菌AmpC酶的方法，其特征在于，该方法的具体检测步骤如下1)先配制APB溶液用二甲基亚砜作为溶剂，配成浓度为40mg/ml的溶液；所述APB分子式为C6H8BNO2.H2O，分子量为15496；2)取10μl上述APB溶液分别加入英国OXOID公司生产的每片含30μg CAZ、30μg CTX和30μg FOX的纸片上，使每片测试纸片上含APB 400μg，以制成CAZ/APB、CTX/APB和FOX/APB纸片；待纸片干后，置于2-8℃的温度下保存备用。3)具体实验操作(1)将新鲜培养的待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M-H平板；(2)将不含有APB的CAZ、CTX和FOX纸片及含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片分别贴于涂布有待检菌的M-H平板表面，35℃培养过夜，观察并分别记录含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片与不含APB的CAZ、CTX和FOX纸片抑菌环直径；(3)结果判读含有APB比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX纸片抑菌环直径增加5mm或以上者判为AmpC酶阳性。本专利技术的有益效果是该项检测是利用纸片扩散法药敏实验的特点，将AmpC酶抑制剂APB加至含有三种AmpC酶底物(CAZ，CTX，FOX)的药敏纸片上，通过测定加APB与不加APB的药敏纸片抑菌环直径改变来判断AmpC酶的存在，避免了使用单一底物可能带来的漏检，提高检测的阳性率。该实验还具有操作简单，成本低廉，结果判读清晰，重复性好，不需要特殊实验条件的优点，易于在临床实验室推广应用。具体实施例方式本专利技术提供一种用含3-氨基苯酚硼酸的纸片检测细菌AmpC酶的方法。该方法的检测原理是由于硼酸是AmpC酶的抑制剂，本项专利技术在不加3-氨基苯酚硼酸APB的CAZ，CTX和FOX纸片基础上，添加APB至CAZ，CTX和FOX纸片，进行纸片法药敏实验，即APB纸片增强法，检测细菌产生的AmpC酶。APB可使CAZ或/和CTX或/和FOX纸片对产生AmpC酶细菌的抑菌环扩大，当含有APB的CAZ或/和CTX或/和FOX纸片比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX纸片抑菌环直径增加5mm或以上时，判为AmpC酶检测阳性。该方法的具体检测步骤如下1)先配制APB溶液用二甲基亚砜作为溶剂，配成浓度为40mg/ml的溶液；所述APB分子式为C6H8BNO2.H2O，分子量为15496；2)取10μl上述APB溶液分别加入英国OXOID公司生产的每片含30μg CAZ、30μg CTX和30μg FOX的纸片上，使每片测试纸片上含APB 400μg，以制成CAZ/APB、CTX/APB和FOX/APB纸片；待纸片干后，置于2-8℃的温度下保存备用。3)具体实验操作(1)将新鲜培养的待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M-H平板；(2)将不含有APB的CAZ、CTX和FOX纸片及含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片分别贴于涂布有待检菌的M-H平板表面，35℃培养过夜，观察并分别记录含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片与不含APB的CAZ、CTX和FOX纸片抑菌环直径；(3)结果判读含有APB比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX纸片抑菌环直径增加5mm或以上者判为AmpC酶阳性。举例说明例1，男性，51岁，临床诊断为呼吸道感染，从其送检痰液标本中分离到肺炎克雷伯菌，用不含有APB的CAZ、CTX和FOX纸片及含有本专利技术制备的APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片分别贴于涂布有分离到肺炎克雷伯菌的M-H平板表面，35℃培养过夜，即采用纸片增强法检测结果如下含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片的抑菌环直径分别是22mm，25mm和13mm；不含APB的CAZ、CTX和FOX纸片抑菌环直径分别是15mm，20mm和6mm。从而计算出含有APB比不含APB的CAZ，CTX和FOX纸片抑菌环直径分别增加了7mm，5mm和7mm，均在5mm以上。判定为A.mpC酶阳性。故该病人是由产AmpC酶的肺炎克雷伯菌引起的呼吸道感染。例2，女性，50岁，临床诊断为泌尿道感染，从其送检尿液标本中分离到大肠艾希菌，用与例1相同的两种纸片分别贴于涂布有分离到大肠艾希菌的M-H平板表面，35℃培养过夜，增强法检测，其结果如下含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB纸片的抑菌环直径分别是21mm，24mm和12mm；不含APB的CAZ、CTX和FOX纸片抑菌环直径分别是16mm，20mm和10mm。从而计算出含有APB比不含APB的CAZ，CTX和FOX纸片抑菌环直径分别增加了5mm，4mm和2mm，虽然仅CAZ/APB纸片比CAZ纸片抑菌环直径增加了5mm，仍然判定为AmpC酶阳性。故该病人是由产AmpC酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用含３－氨基苯酚硼酸的纸片检测细菌ＡｍｐＣ酶的方法，其特征在于，该方法的具体检测步骤如下：１）先配制ＡＰＢ溶液：用二甲基亚砜作为溶剂，配成浓度为４０ｍｇ／ｍｌ的溶液；所述ＡＰＢ分子式为Ｃ↓［６］Ｈ↓［８］ＢＮＯ↓［２］．Ｈ↓［２］Ｏ，分子量为１５４９６；２）取１０μｌ上述ＡＰＢ溶液分别加入英国ＯＸＯＩＤ公司生产的每片含３０μｇＣＡＺ、３０μｇＣＴＸ和３０μｇＦＯＸ的纸片上，使每片测试纸片上含ＡＰＢ４００μｇ，以制成ＣＡＺ／ＡＰＢ、ＣＴＸ／ＡＰＢ和ＦＯＸ／ＡＰＢ纸片；待纸片干后，置于２－８℃的温度下保存备用。３）具体实验操作（１）将新鲜培养的待检菌制成０．５麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至Ｍ－Ｈ平板；（２）将不含有ＡＰＢ的ＣＡＺ、ＣＴＸ和ＦＯＸ纸片及含有ＡＰＢ的ＣＡＺ／ＡＰＢ，ＣＴＸ／ＡＰＢ和ＦＯＸ／ＡＰＢ纸片分别贴于涂布有待检菌的Ｍ－Ｈ平板表面，在３５℃下培养过夜，观察并分别记录含有ＡＰＢ的ＣＡＺ／ＡＰＢ，ＣＴＸ／ＡＰＢ和ＦＯＸ／ＡＰＢ纸片与不含ＡＰＢ的ＣＡＺ、ＣＴＸ和ＦＯＸ纸片抑菌环直径；（３）结果判读：含有ＡＰＢ比不含ＡＰＢ的ＣＡＺ或／和ＣＴＸ或／和ＦＯＸ纸片抑菌环直径增加５ｍｍ或以上者判为ＡｍｐＣ酶阳性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈定霞，罗燕萍，张有江，徐雅萍，周光，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：11[]
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