本发明专利技术提供了用于随后质谱分析的核酸的快速溶液俘获纯化方法，该方法相对于现有的方法是有效的和有成本效益的。本发明专利技术还提供了实施快速溶液俘获核酸的试剂盒，使得纯化的样品处于可以通过电雾化质谱分析的状态。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总地涉及通过质谱分析核酸的领域，并提供了用于该目的的方法和试剂盒。
技术介绍
电雾化电离质谱(ESI-MS)已经成为生物聚合物分析的重要技术。该多电荷现象可以快速、准确和精确测量非常大质量生物聚合物的分子量、鉴定改变以及进行更详细的结构研究。利用聚合酶链反应的特定DNA序列的扩增已经在许多特定学科中得到了广泛应用，包括微生物学、医学研究、法医检定和临床诊断。更常见的，使用传统生化技术如使用嵌入染料或荧光标记引物的标准凝胶电泳将PCR产物“按大小排列”。广泛用于多种基于PCR的诊断试剂盒中的TapmanTM试验能证实特定PCR产物的存在(或不存在)，但不提供扩增子大小的直接读数。所谓的“实时”PCR装置，在扩增循环中测量激光诱导的PCR产物的荧光，用于定量所给DNA模板和引物对的DNA扩增。这些方法对于相对小的扩增子(少于150个碱基对)的使用受到限制，因为成比例高的荧光背景，且不提供任何关于扩增子异质性或确切长度的信息。和这些更传统的方法相比较，质谱作为在其上表征PCR产物的平台具有数个潜在优势，包括速度、灵敏度和质谱精确度。因为每个含有DNA的碱基的确切质量是已知具有高度精确性的，通过质谱获得的高精确度质量测量可以用来得出实验获得的质量测量不确定性中的碱基组成(J.Aaserud，Z.Guan，D.P.Little和F.W.McLafferty，Int.J.Mass Spectrom.Ion Processes，1997，167/168，705-712和D.C.Muddiman，G.A.Anderson，S.A.Hofstadler和R.D.Smith，Anal.Chem.1997，69，1543-1549)。使用核酸扩增和通过分子量分析确定提供信息扩增子的碱基组成的组合快速鉴定未知生物试剂的方法公开且要求于公开的美国专利申请20030027135，20030082539，20030124556，20030175696，20030175695，20030175697和20030190605和美国专利申请Nos.10/326,047，10/660,997，10/660,122和10/660,996中，所有都是共有的且在此以其整体引入作为参考。已经使用MALDI(基质辅助的，激光解吸电离)和电雾化(ESI)质谱来电离PCR产物用于随后的质谱检测。虽然MALDI广泛用于分析短的(20-mer或更小的)寡核苷酸，但是应用于超过100bp的扩增子不太常见。由于电离过程的内在“柔软度”，ESI是大生物分子最广泛使用的电离技术之一，其可以使超过500bp的DNA得到电离而不离解。ESI中，在“气动雾化”过程中产生大的带电的微滴，其中迫使分析物溶液通过针，在针末端运用电势，该电势足以将形成的溶液分散成非常细喷雾的带电微滴，所有带电微滴具有相同的极性。溶剂蒸发，压缩微滴大小并提高微滴表面的电荷浓度。最后，在瑞利限度，库仑斥力克服了微滴的表面张力，微滴破裂。该“库仑斥力”形成一系列较小的、带较低电荷的微滴。重复压缩接着破裂的过程直至形成单个带电的分析物离子。电荷统计地分布在分析物可获得的电荷位点中，导致多电荷离子状态形成的可能。通过将干气流反电流引至雾化的离子来提高溶剂蒸发率，提高了多电荷的程度。降低毛细管直径并降低分析物溶液的流速，即在纳米雾化电离中，将产生m/z比例高于那些通过“常规”ESI产生的离子(即，其是较软的电离技术)，且更多地用于生物分析领域中。不幸地，ESI需要相对干净的样品且众所周知地不可耐生化实验室中常用的阳离子盐、去污剂和许多缓冲液。通常用于聚合酶链反应中的缓冲系统含有电雾化不相容试剂如50mM KCl，2mM MgCl2，10mM Tris-HCl，和200M的四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的每种。甚至相对低浓度(低于100M)金属离子的存在能显著降低寡核苷酸的MS灵敏性，因为每种分子离子的信号随着多个盐加合物而展开。因此，除了除去去污剂和dNTP，PCR产物的有效ESI-MS需要在分析之前将盐浓度降低高于1000倍。已经使用乙醇沉淀来将PCR产物脱盐，随后作为短的寡核苷酸用于MS分析，并除去盐而将样品浓缩(M.T.Krahmer，Y.A.Johnson，J.J.Walters，K.F.Fox，A.Fox和M.Nagpal，Electrospray Anal.Chem.1999，71，2893-2900；T.Tsuneyoshi，K.Ishikawa，Y.Koga，Y.Naito，S.Baba，H.Terunuma，R.Arakawa和D.J.Prockop RapidCommun.Mass Spectrom.1997，11，719-722；和D.C.Muddiman，D.S.Wunschel，C.L.Liu，L.Pasatolic，K.F.Fox，A.Fox，G.A.Anderson和R.D.Smith Anal.Chem.1996，68，3705-3712)。该方法中，将PCR产物从浓缩的醋酸铵溶液中沉淀出来，在5℃过夜或用冷(-20℃)乙醇处理10-15分钟。不幸地，单独的沉淀步骤通常不足以获得合适脱盐的PCR产物来获得高质量ESI质谱；因此，沉淀后通常为渗析步骤来进一步将样品脱盐(D.C.Muddiman，D.S.Wunschel，C.L.Liu，L.Pasatolic，K.F.Fox，A.Fox，G.A.Anderson和R.D.Smith Anal.Chem.1996，68，3705-3712)。虽然数个研究者已经成功使用这些方法来表征多个PCR产物，但是以稳固和完全自动化高处理量的方式使用这些方法的途径不明显。商业DNA纯化试剂盒也可以和传统脱盐技术如微量渗析结合使用(S.Hahner，A.Schneider，A.Ingendoh和J.Mosner Nucleic AcidsRes.2000，28，e82/i-e82/viii；和A.P.Null，L.T.George和D.C.Muddiman.J.Am.Soc.Mass Spectrom.2002，13，338-344)。其它纯化技术，如凝胶电泳，接着高效液相色谱或液滴渗析，或使用膜或树脂的阳离子交换，也已经用来获得用于MS检测的高纯度的、脱盐的DNA(L.M.Benson，S.-S.Juliane，P.D.Rodringues，T.Andy，L.J.Maher III和S.Naylor，InThe 47thASMS Conference on MassSpectrometry and Allied Topics，Dallas，Texas(1999)；C.G.Huber和M.R.Buchmeiser Anal.Chem.1998，70，5288-5295；H.Oberacher，W.Parson，R.Muehlmann和C.G.Huber Anal.Chem.2001，73，5109-5115；和C.J.Sciacchitano J.Liq.Chromatogr.Relat.Technol.1996，19，2165-2178)。不幸地，因为使用上述技术，实现快速和完全自动化高处理量的路径不明显。Ji本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有核酸溶液的纯化方法，包括： 将所述溶液和阴离子交换树脂混合来产生所述阴离子交换树脂在所述溶液中的悬浮液，其中所述核酸和所述阴离子交换树脂结合； 从所述溶液中分离所述阴离子交换树脂； 用一种或多种洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换树脂来除去一种或多种污染物，而保留结合的核酸； 用洗脱缓冲液从所述离子交换树脂洗脱所述核酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SA霍弗斯塔德勒，LL卡敏斯，
申请(专利权)人：伊希斯药品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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