涉及药物代谢酶的电化学传感分析制造技术

公开了将电子从电极转移到在溶液内的哺乳动物的氧化药物代谢酶（ＤＭＥ）上的电化学介体的用途，以便尤其进行分析以确定候选药物通过ＤＭＥ新陈代谢。在不存在用于ＤＭＥ分子的还原酶的情况下进行藉助介体转移电子。介体与ＤＭＥ分子在溶液内和／或固定到电极上。在介体固定到电极上的情况下，这可在电极上形成保护层，从而减少或防止因与电极直接接触引起的ＤＭＥ分子变性。还公开了用于这一分析方法的电极和电化学反应室。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及电化学介体的用途，尤其是用于测定候选药物通过氧化药物代谢酶(DME)的新陈代谢的用途，和在这种分析中使用的电极、电化学反应室和器件。在药物工业中感兴趣的主要领域是预测药物如何在体内新陈代谢。主要的药物新陈代谢过程之一，第I阶段的氧化新陈代谢，主要由细胞色素P450(Cyp)或黄素单加氧酶(FMO)族酶，所谓的氧化药物代谢酶(DME)介导，DME的主要生理作用是将羟基部分添加到外来分子上，从而促进其新陈代谢降解。催化反应可概述为其中RH可以是大范围的可能底物之一。当通过DME研究候选药物的新陈代谢时，所测量的关键参数是这一反应对于不同候选药物的最大速度(Vmax)和得到一半Vmax时的候选药物浓度(一个被称为Km的参数)(附图说明图1)。Vmax是DME可如何快速地处理候选药物的量度，和Km表示候选药物与DME之间的结合亲和力。这两个参数之比(Vmax/Km)被称为固有清除率CLint，它可被认为是在没有影响血流或结合的情况下，候选药物从肝脏血浆中的清除速度。良好的候选药物具有非常低的CLint，这意味着它们抗DME降解；而具有高CLint的差候选药物非常快速地降解。通过电子转移驱动通过氧化还原酶，如DME催化的反应。图2示出了通常被接受的Cyp催化循环。当底物结合到活性位点(1)上时，开始反应。若将进一步进行反应，底物必须取代通常共配位到未结合的Cyp内的血红素铁原子上的水分子。通过Fe3+离子自旋状态的变化，从其中5个3d电子最大成对的低自旋(1/2)状态变化为其中电子最大不成对的高自旋(5/2)状态，从而实现这一取代。这反过来会引起约100mV的铁的氧化还原电势的变化，这一变化足以通过热动力学有利的Cyp的氧化还原配对(partner)(通常为NADPH或NADH)(2)使铁还原，还原步骤之后接着是O2分子结合到与Fe3+离子相邻的独立位点上(3)。这一状态不稳定，并容易自动氧化释放O2-。然而，若发生第二电子的转移(4)，则催化反应继续。O22-与来自周围溶剂的质子反应，形成H2O(被释放)，从而得到活化的氧原子(5)。然后它可与底物分子反应(6)，从而导致底物的羟化形式(7)，然后将其从活性位点处释放。驱动这一反应循环的电子通常在体内在合适的氧化还原酶辅助下，通过氧化还原配对供应。在DME的情况下，氧化还原配对通常是烟酰胺腺嘌蛉二核苷酸磷酸(NADPH)，它在氧化态(NADP+)和还原态之间转换。目前的体外DME分析要求合理的复杂反应混合物，它能再生合适氧化态的氧化还原配对。例如，重组P450已与重组P450还原酶和NADPH结合使用。尽管可发光光度法追踪NADPH的消耗，但在电子流动和产物形成之间的关联是可变的，因此，NADPH的消耗可能不是候选药物新陈代谢的可靠指示剂。这一分析的进一步的缺点是P450还原酶昂贵。已表明可通过在电化学反应室内直接使用电极供应电子来人工驱动氧化还原酶反应。例如，已开发了其中藉助介体，sepulchrate钴，由铂电极电化学驱动含NADPH-细胞色素P450还原酶和细胞色素P450的融合蛋白质的体系(Estabrook，R.W.et al.，Endocrine Research22(4)，665-671(1996))。然而，这一体系的缺点是，细胞色素P450必须以具有细胞色素P450还原酶的融合蛋白质形式提供，且由于它们依赖于还原酶和细胞色素P450之间的关联，因此不可能获得可靠的结果。WO 00/22158公开了将细胞色素P450连接到石墨电极上，以便可在不需要P450还原酶的情况下将电子供应到酶上。这一文献还公开了在溶液中使用修饰的金电极供应电子到细胞色素P450内。尽管这些研发工作，然而尚未充分电化学地利用DME，这主要是由于难以实现电子从电极有效转移到酶的活性位点上所致。进一步的问题是，蛋白质在电极表面上容易变性，尤其若电极是金属的话。大多数蛋白质表面携带能结合到具有相当高亲和力的金属表面上的大量官能团，和接触这一表面的任何蛋白质分子可能粘附其上并解折叠，从而变得失活且使具有绝缘层的电极“中毒”。国际专利申请No.PCT/GB03/02756是在本申请的优先权和申请日之间申请的悬而未决的申请。它涉及利用电化学传感预测通过DME的药物新陈代谢。它认为最大化电子从电极转移到酶内催化位点的一种方式是在电极表面上固定酶。在一个实施方案中，电极被共价修饰。电极，例如金属(典型地，但不仅仅是金)或石墨的表面，通过共价添加化学基团来修饰，使得更易于将电子转移到蛋白质上。一种技术涉及结合金电极使用有机硫醇盐(organothiloate)化合物(其含有SH基)。硫醇基形成与金属表面强的键合，和其余分子提供合适的官能团供与蛋白质相互作用。在PCT/GB03/02756的进一步的实施方案中，使用微孔电解质膜。这些是以薄层形式涂布电极表面的、具有高离子导电率的机械和化学稳定的聚合物凝胶。应当选择含凝胶的聚合物，提供在其基质内捕获蛋白质的合适环境，如高比例的羧酸基(例如对于许多荷正电的表面残基的蛋白质来说)、胺基(对于具有许多负电荷在表面上的蛋白质来说)，或脂族基团(对于具有大部分疏水表面的蛋白质来说)。PCT/GB03/02756的进一步的实施方案涉及使用类脂膜。天然CYP酶通常发现附着在生物膜上，因为在磷脂双层内它们几乎仅仅含有充当锚的区域。确实，通常修饰在该分析实验室内使用的CYP以除去这一锚区域，从而使得可增溶该酶。CYP对类脂双层膜的亲和力提供锚定它们在电极表面上的方式。可使用沉积在表面上的长链脂肪酸或类似分子构造合适的膜。本专利技术涉及电子从电极转移到DME的催化位点上，当它在溶液内且没有固定在电极上时。根据本专利技术，提供将电子从电极转移到在溶液内的氧化药物代谢酶(DME)的分子上的电化学介体的用途，其中介体在溶液内。根据本专利技术，在不存在用于DME分子的还原酶的情况下，进行电子通过介体从电极到DME分子上的转移。与介体分子相比，DME分子是大分子，因此仅仅缓慢地扩散到并离开电极表面。由于介体分子能比DME分子快速得多地扩散，因此在本体溶液中它们能在电极表面和DME分子之间来回穿梭，从而携带一个或多个电子。介导的电子转移速度因此比通过DME分子所实现的大得多，电极的可寻址体积于是增加，并进而与DME分子单独相比，显著改进信号对噪音比。此处使用术语“氧化DME”包括Cyp和FMO。作为尚未识别的氧化DME，例如作为人类基因组计划的结果，也可发现其它的氧化DME，且也包括在这一术语范围内，氧化DME可以是天然存在的氧化DME，或者重组氧化DME，或保持药物新陈代谢活性的这些的衍生物。这种衍生物的实例是不包括膜结合所要求的氨基酸残基，以便增加其溶解度的酶。氧化DME应当是II类药物代谢酶(在体内，这些酶要求依赖于黄素蛋白质NADPH的还原酶，且包括哺乳动物和一些细菌P450)，而不是I类药物代谢酶(在体内，这些酶要求依赖于NADPH的还原酶和铁-硫蛋白质，且包括大多数细菌P450和线粒体类固醇代谢酶)。优选地，氧化DME是人类氧化DME。然而，在一些情况下，可希望使用非人类氧化DME，如老鼠或小鼠氧化DME。术语“介体”包括具有E0值接近于DME本文档来自技高网...

【技术保护点】
在不存在用于药物代谢酶（ＤＭＥ）分子的还原酶的情况下，将电子从电极转移到在溶液内的哺乳动物氧化ＤＭＥ分子上的电化学介体的用途，其中该介体与ＤＭＥ分子一起在溶液内。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R吉尔伯特，
申请(专利权)人：E二V技术英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]