本发明专利技术属于棉花育种领域，涉及一种海岛棉ＥＳＴ－ＳＳＲ引物序列的制备技术及应用，利用这些引物进行棉花遗传多样性的评价、分子遗传连锁构建和棉花重要性状的ＱＴＬ定位。步骤包括：１）建立海岛棉品系Ｐｉｍａ３－７９纤维发育的ｃＤＮＡ文库，从单一序列中挑出占其中富含二、三、四、五或六核苷酸重复且长度≥１０碱基的ＥＳＴ；２）设计ＳＳＲ侧翼引物；３）从田间取基因型为ＡＡ、ＤＤ和ＡＡＤＤ的棉种材料和亲本鄂棉２２、Ｐｉｍａ３－７９以及ＢＣ↓［１］群体植株的嫩绿叶片提取其总ＤＮＡ；４）用设计的ＳＳＲ引物扩增步骤３）所示的材料和群体；５）计算每对引物的多态性信息含量，并对步骤３）所示的基因型棉种材料作聚类和主坐标分析；６）将ＢＣ↓［１］作图群体扩增的ＥＳＴ－ＳＳＲ整合到种间遗传连锁图谱相应的连锁群上，并作棉花重要性状的ＱＴＬ定位。结果显示，位于连锁群１５的引物ＨＡＵ０３３与籽指性状连锁，位于连锁群２９的引物ＨＡＵ１００与单株铃数性状连锁；分别贡献了表型变异的７．４１％和５．９５％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于棉花育种
，具体涉及一种海岛棉EST-SSR引物序列的制备技术及应用，具体涉及利用这些引物序列进行棉花遗传多样性的评价、分子遗传连锁构建和棉花重要性状的QTL定位。
技术介绍
简单序列重复(简称SSR)标记具有重复性好、多态性高、呈共显性遗传、数量丰富和遍布整个基因组等优点，这些优点使得SSR标记成为广泛使用的分子标记之一，然而按照传统的方法开发SSR标记不仅费时费力而且效率低。随着功能基因组学的发展，表达序列标签(EST)因为可以用于新基因的发现、基因表达调控研究和基因芯片的底物而被大量测序，并保存在公共序列数据库中，这些EST为SSR等分子标记的开发提供了丰富的序列资源。基于EST序列开发的EST-SSR标记与传统的SSR标记相比有很多优点，如EST-SSR标记在相关物种之间具有很高的可转移性；EST-SSR标记通常都代表着某种功能，这种功能可以通过序列同源性比对获得；由于利用的是公共序列，EST-SSR标记的开发过程简单，成本低；EST-SSR能够反映出转录区的差异，这使得EST-SSR在种质遗传多样性分析、分子标记辅助选择和比较作图等研究中具有更高的使用价值。目前，Genbank的EST数据库中已经积累了30多万条EST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html)。这些丰富的EST资源为棉花EST-SSR的发展奠定了基础。目前，已经从亚洲棉和陆地棉的EST中开发了2201对EST-SSR，占棉花SSR总量的40.1％(http://www.mainlab.clemson.edu/cmd/Primer.shtml)。这些标记一经公布，立即被广大研究者应用。目前主要用于遗传连锁图的构建中(Han Z G等，Geneticmapping of EST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreumin allotetraploidcotton.Mol Gen Genom，，2004，272308-327；Han Zhiguo，等，Characteristics，development andmapping of Gossypium hirsutum derived EST-S SRs in allotetraploid cotton.Theor Appl Genet，2006，112430-439；Park Y H等，Genetic mapping of new cotton fiber loci using EST-derivedmicrosatellites in an interspecific recombinant inbred line cotton population.Molecular Geneticsand Genomics，2005，274428-441)，以及棉花纤维品质性状的QTL定位中(Park Y H等，Genetic mapping of new cotton fiber loci using EST-derived microsatellites in an interspecificrecombinant inbred line cotton populaion.Molecular Genetics and Genomics，2005，274428-441；He D H等，QTL mapping for economic traits based on a dense genetic linkage map of cotton withPCR-based markers using the interspecific cross of Gossypium hirsutum/Gossypium barbadense.Euphytica，2006，DOI10.1007/s10681-006-9254-9)。从Genbank的数据库来看，陆地棉的EST数量最大，其次是雷蒙德式棉和亚洲棉，而目前的EST-SSR都是来自这些数据。而栽培种的非洲棉和海岛棉的数据量较少，目前尚没有这两个棉种ESR-SSR的报道。众所周知，四大栽培棉种中，陆地棉和海岛棉分别贡献了世界棉花产量的90％和5％左右。陆地棉因其产量高、适应性强而被广泛种植，也毫无争议地成为棉花研究的首选。海岛棉虽然种植面积远远少于陆地棉，但其纤维品质优良，抗病性强，仍有相当面积的种植，并是主要优质棉纤维产源。海岛棉与陆地棉可以有性杂交，并且二者产量和品质性状互补，海岛棉一直是改良陆地棉品质和抗病性的重要基因源。加强对海岛棉的研究具有重要的理论意义和实践应用价值。为了发掘海岛棉优质纤维基因，申请人构建了海岛棉品种Pima3-79的纤维发育的cDNA文库，并从中开发EST-SSR引物序列，并明确了这些EST-SSR的特征及其在棉花遗传多样性、图谱构建和QTL定位中的应用。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是建立海岛棉EST-SSR标记引物序列，并将其在棉花遗传多样性、遗传连锁图谱构建以及在QTL定位中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现1、适用于基因型为AA、DD和AADD的来源于海岛棉的EST-SSR标记的制备方法，按照下列步骤制备1)建立海岛棉品系Pima3-79纤维发育的cDNA文库，从单一序列中挑出占其中富含二、三、四、五或六核苷酸重复且长度≥10碱基的EST；2)设计SSR侧翼引物，所述的引物如附图1所示；3)从田间取如附图2所示的基因型为AA、DD和AADD的棉种材料和亲本鄂棉22、Pima3-79以及BC1群体植株的嫩绿叶片提取其总DNA；4)用所设计的SSR引物扩增步骤3)所示的材料和群体；5)计算每对引物的多态性信息含量，并对步骤3)所示的三个基因型的棉种材料进行遗传多样性的聚类分析和主坐标分析； 6)将BC1作图群体扩增的EST-SSR标记整合到种间遗传连锁图谱相应的连锁群上，并进行棉花重要性状的QTL定位。在本专利技术中，步骤1)的引物长度为18-25bp，退火温度为55-63℃，GC含量为40-65％，PCR扩增产物的长度为100-300bp。优选地，本专利技术的步骤1)的最适引物长度为20bp，退火温度为57℃，GC含量为50％，PCR扩增产物长度为200bp。附图说明图1是本专利技术中设计的海岛棉EST-SSR引物序列；图2是本专利技术中实施例1从嫩绿叶片提取其总DNA进行分析的棉花品系和材料；图3是本专利技术的引物HAU042对36个棉花品系的扩增图，M为100bp ladder；图4是本专利技术的引物分析的36个棉花品系的相似系数聚类图；图5是本专利技术的引物分析的36个棉花品系的Principle Coordinate Analysis的三维散点图；图6是本专利技术的引物HAU035对亲本鄂棉22、Pima3-79、F1和69个BC1单株的扩增图，图中M为100bp ladder；图7是本专利技术的引物在连锁群上的分布，并用下划线标出；以下结合说明书及附图对本专利技术作进一步描述1、供试材料选自36份棉种材料(其中基因型为AA的材料13个，基因型为DD的材料11个本文档来自技高网...
【技术保护点】
适用于基因型为ＡＡ、ＤＤ和ＡＡＤＤ的来源于海岛棉的ＥＳＴ－ＳＳＲ标记的制备方法，按照下列步骤： １）建立海岛棉品系Ｐｉｍａ３－７９纤维发育的ｃＤＮＡ文库，从单一序列中挑出占其中富含二、三、四、五或六核苷酸重复且长度≥１０碱基的ＥＳＴ； ２）设计ＳＳＲ侧翼引物，所述的引物如附图１所示； ３）从田间取如附图２所示的基因型为ＡＡ、ＤＤ和ＡＡＤＤ的棉种材料和亲本鄂棉２２、Ｐｉｍａ３－７９以及ＢＣ↓［１］群体植株的嫩绿叶片提取其总ＤＮＡ； ４）用所设计的ＳＳＲ引物扩增步骤３）所示的材料和群体； ５）计算每对引物的多态性信息含量，并对步骤３）所示的三个基因型的棉种材料进行遗传多样性的聚类分析和主坐标分析； ６）将ＢＣ↓［１］作图群体扩增的ＥＳＴ－ＳＳＲ标记整合到种间遗传连锁图谱相应的连锁群上，并进行棉花重要性状的ＱＴＬ定位。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张献龙，林忠旭，张艳欣，涂礼莉，聂以春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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