一种城市污水中浮游生物群落ＤＮＡ指纹的分析方法，包括采用针对１６ＳｒＤＮＡ和１８Ｓ ｒＤＮＡ的引物扩增污水中浮游生物群落的宏基因组，并进行变性梯度凝胶电泳以获得群落ＤＮＡ指纹图谱。第一步是提取浮游生物群落的宏基因组ＤＮＡ；第二步是扩增宏基因组的目标条带；第三步是进行ＤＧＧＥ电泳分离以获得浮游生物群落ＤＮＡ指纹图谱；第四步是利用ＤＮＡ凝胶软件分析ＤＧＧＥ凝胶照片，利用条带的光密度值来表示条带，然后利用统计学软件对数据进行分析。本方法方便快捷，重复性好，灵敏度高，成本低廉，可应用于城市污水的生物监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物分子生态学领域的分析方法，具体是一种利用 PCR-DGGE分析城市污水中浮游生物生物群落DNA指纹图谱的技术，即通过 PCR-DGGE分析城市污水中浮游生物群落DNA多态性，利用其多态性分析各个 污水处理阶段间的关系以及活性污泥的运行状况。
技术介绍
城市污水处理厂的二级污水处理工艺大都是活性污泥法及其改进工艺，其原 理是通过由各种细菌、真菌、藻类和原生动物等构成的一个复杂的生态系统，对 有机污染物进行生物降解，同时除去污水中过量的磷和氮、吸附重金属离子甚至 浮游病毒等，来达到净化水质的目的。污水处理厂通常只检测常规理化指标以判 断污水处理效果，很少对浮游生物群落进行监测。城市污水来源复杂，通常含有 多种污染物，若同时结合浮游生物群落动态对污水处理效果进行评价，则不但能 了解污染物浓度的变化情况，还可了解其对浮游生物群落的影响，从而揭示活性 污泥的运行状态，并对此后的污水处理效果进行预报。传统的污水微生物群落的检测一般通过各种培养基进行纯化培养来鉴定菌 种，但传统的微生物分离培养技术存在诸多瓶颈，如大多数微生物难以进行分离 培养；少数能进行分离培养的需要较复杂的培养条件；分离培养出来菌种不一定 是污水中优势类群，很可能只是较其它菌种更易在培养基上生长； 一些数量较少，4起重要作用的细菌种群很可能因难以在培养基上生长而被忽略。有鉴于此，微生 物学家将分子生物学的方法引入生态学研究，希望能弥补分类学上的不足，进而 希望得到更真实和更全面的微生物群落的信息。自变性梯度凝月交电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术被用 于分子生态学研究以来，己经成为研究生物群落多样性的重要工具。PCR-DGGE 技术具有灵敏度高，重复性好，易操作，能同时分析多个平行样品而被人广泛应 用与微生物分子生态学的研究中。人们已经利用PCR-DGGE技术分析了环境中微 生物群落的DNA指纹，从而揭示了更加丰富的生物多样性。目前的研究主要集 中在对土壤、湖泊、河流和废水等各种环境中细菌群落结构及功能的研究，同时 有少量关于环境中古细菌、真菌和真核藻类群落多样性的研究。当前的研究手段 主要是利用针对原核生物16S rRNA基因V3或V4 V5区设计的特异引物扩增环 境样品中的生物群落DNA，尤其是在废水和活性污泥生物群落的研究中该方法 应用的更加广泛。但是，对于污水处理中同样占有十分重要地位的真菌以及其它 真核生物却常常被忽略了 。利用针对原核生物16S rDNA和真核生物18S rDNA设 计的引物，同时进行原核生物及真核生物群落多样性的研究，对于全面掌握污水 中浮游生物群落的动态是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是在现有的基础上进一步完善微生物群落DNA指纹检测方 法，提供一种城市污水中浮游生物群落DNA指纹的分析方法。传统的微生物鉴 定工作繁琐耗时，而且大部分的微生物难以培养，本方法避免了对污水中微生物 (如细菌、真菌)进行传统的分类学鉴定，快速地对污水中浮游生物的多样性进 行分析，所得结果可以准确地反映污水中浮游生物群落结构，尤其是在以往只分 析细菌群落的基础上加入了真核生物DNA指纹图谱，使本方法能更加全面的分 析污水中浮游生物群落的结构。本专利技术通过以下技术方案实现，其具体步骤是.-1.浮游生物群落的宏基因组DNA提取直接使 用采水器采得城市污水水样，水样充分混匀，吸取混匀水样转入1.5 mL离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，转速为10000 r/min，时间5 min，然后用灭菌双蒸水清洗沉淀，再离心一次，将所获沉淀悬浮于1.5mL灭菌的TENP 缓冲液中，TENP缓冲液含有50 mmol/LTris-base; 20 mmol/L EDTA; 100 mmol/L NaCl; 0.01 g/mL聚乙烯吡咯烷酮；pH-lO，接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心 去除上清液，转速为8000r/min，日寸间5min。去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀， 然后再次离心，重复清洗沉淀的步骤直至上清液清亮。最后将沉淀悬浮于300 mL 灭菌双蒸水，置于液氮中lmin，室温(20-25°C)下融解，待样品完全融解后直 接加入裂解液，裂解液含有0.5%SDS; 10mmol/LTris-Cl,pH= 8.0; 0.1 mol/L EDTA ， pH = 8.0; 100 ng/mL蛋白酶K,然后将样品置于水浴箱中5(TC温浴裂解 过夜。DNA抽提参照使用酚一氯仿抽提法，最后加TE缓冲液溶解，取溶解的DNA 用0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳评估，其余DNA-2(TC保存。2. 采用特异性引物污水中浮游生物群落的宏基因组PCR扩增所用引物原核生物16SrDNA引物为Pl(5，-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3，)和P2 (5'-ATTACC GCG GCT GCT GG-3，)；真核生物18S rDNA引物为P3 (5，-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CTC TGT GAT GCC CTT AGA TGT TCT GGG-3')和P4 (5，-GCG GTG TGA CAA AGG GCAGGG-3')。 PCR扩增采用50pL的反应体系，其中包含有10XPCRbuffer(不 含Mg2十)，5pL; MgCl2溶液，25 mmol/L, 4 ^L; dNTP， 2 mmol/L， 2pL;引物P1 和P2或P3和P4， lO^mol/L,各0.8 ^L; Taq酶3.0 U;模板DNA20ng左右；最后加 灭菌双蒸水补足至终体积50 pL。采用Touchdown PCR模式，运行条件如下94 。C， 5min;然后94。C下变性1 min; 69。C或67X:下退火30s; 72。C下延伸lmin，之 后每个循环降rC，共10个循环；再进行18或20个扩增循环，扩增参数为94i:下 变性lmin; 59'C或57'C下退火30s; 72'C延伸1 min;最后72"延伸10 min，反应 终止于4'C。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳确认目标片段。3. 变性梯度凝胶电泳电泳在INGENYphorU-2 system中进行，所用胶浓度为9%，聚丙烯酰胺配 制凝胶的溶液含有丙烯酰胺21.9156g， N，N'-甲叉双丙烯酰胺0.5844g， 50XTAE 5mL，最后加灭菌双蒸水补足至终体积250mL。进行两次变性梯度凝胶电泳 (DGGE)，以获得群落DNA指纹图谱。第一次采用较宽的变性梯度30%—70%，根据结果在第二次电泳时调整变性梯度为以获得最好效果。运行条件:在1 XTAE 缓冲液中，6(TC恒温，120V恒电压条件下运行llh左右。凝胶用溴化乙锭染色 20min，经UVP成像分析系统拍照得到DNA指纹图谱。 4.利用软件对图谱进行分析利用Quantity One (Bio-Rad,美国)软件分析浮游生物群落DNA指纹图谱 获得光密度值等数据，利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种城市污水中浮游生物群落ＤＮＡ指纹的分析方法，其特征在于： Ａ．浮游生物群落的宏基因组ＤＮＡ提取： 直接使用采水器采得污水水样，水样充分混匀，吸取混匀水样转入离心管，离心获得沉淀，并去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，再离心一次，将所获沉淀悬浮于灭菌的ＴＥＮＰ缓冲液中，接着将沉淀悬浮液振荡混匀，离心去除上清液，灭菌双蒸水清洗沉淀，然后再次离心，最后将沉淀悬浮于灭菌双蒸水，置于液氮中，室温下融解，待样品完全融解后直接加入裂解液，然后将样品置于水浴箱中温浴裂解过夜，ＤＮＡ抽提参照使用酚－氯仿抽提法，最后加ＴＥ缓冲液溶解，取溶解的ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳评估，其余ＤＮＡ－２０℃保存； Ｂ．采用特异性引物扩增污水中浮游生物群落的宏基因组： ＰＣＲ扩增采用５０μＬ的反应体系，其中包含有：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（不含Ｍｇ↑［２＋］），５μＬ；ＭｇＣｌ↓［２］溶液，２５ｍｍｏｌ／Ｌ，４μＬ；ｄＮＴＰ，２ｍｍｏｌ／Ｌ，２μＬ；引物Ｐ１和Ｐ２或Ｐ３和Ｐ４，１０μｍｏｌ／Ｌ，各０．８μＬ；Ｔａｑ酶３．０Ｕ；模板ＤＮＡ２０ｎｇ；最后加灭菌双蒸水补足至终体积５０μＬ，采用Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ ＰＣＲ模式，运行条件如下：９４℃，５ｍｉｎ；然后９４℃下变性１ｍｉｎ；６９℃或６７℃下退火３０ｓ；７２℃下延伸１ｍｉｎ，之后每个循环降１℃，共１０个循环；再进行１８或２０个扩增循环，扩增参数为９４℃下变性１ｍｉｎ；５９℃或５７℃下退火３０ｓ；７２℃延伸１ｍｉｎ；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，反应终止于４℃，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳确认目标片段； 扩增１６Ｓ ｒＤＮＡ的引物： 正向引物Ｐ１：５’－ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’； 反向引物Ｐ２：５’－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’； 扩增１８Ｓ ｒＤＮＡ的引物： 正向引物Ｐ３：５’－ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴＴＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＧ－３’； 反向引物Ｐ４：５’－ＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧ－３’； Ｃ．变性梯度凝胶电泳： 电泳在ＩＮＧＥＮＹｐｈｏｒＵ－２ ｓｙｓｔｅｍ中进行，所用胶浓度为９％聚丙烯酰胺，配制凝胶的溶液含有：丙烯...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余育和，张翔，冯伟松，颜庆云，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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