本发明专利技术公开了一种痰中增殖诱导配体ｍＲＮＡ定量测定方法，包括引物合成、ＡＰＲＩＬ定量质粒标准品及β↓［２］Ｍ定量质粒标准品的构建、痰中ＡＰＲＩＬｍＲＮＡ含量测定等步骤。本发明专利技术准确可靠，可作为肺癌发生的有效检测指标。方法简便、易操作。可为肺癌的临床诊断提供一种经济简便而有效可行的辅助手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种痰中增殖诱导配体mRNA测定方法。
技术介绍
肺癌严重威胁人类的健康和生命，是人类致死的主要病因之一，且 发病率逐年增多。研究表明，肺癌的发生与基因表达变化有关，基因改变可涉及癌变的初始发生和后续发展。增殖诱导配体(a proliferation—inducing ligand， APRIL)是月中瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族中的一员，1998年首先由Hahne等发现并 克隆成功。APRIL在正常组织仅有少量表达，而在肿瘤特别是消化道肿瘤 (包括直肠、结肠、十二指肠)中呈高表达。已有研究证实，APRIL与肿 瘤的生长调节密切相关，在体内和体外均能剌激肿瘤细胞生长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种准确可靠，作为肺癌发生的检测指标的 。本专利技术的技术解决方案是一种，其特征是包括下列步骤(1)引物合成依据Genebank收录人APRIL mRNA和0 2微球蛋 白mRNA,用Primer Premier 5. 0软件设计引物，其中APRIL和P 2M弓|物跨内含子，APRIL下游引物跨越327bp的第1个内含子，^2M上游引 物跨越3811bp的第l个内含子；APRIL上游引物:5， -ACT CTC AGT TGC CCTCTGGTTG-3， (819nt 840nt) ， APRIL下游引物5， -GGA ACT CTG CTC CGG GAG ACT C-3， (984nt 1005nt)，扩增片段长度187bp; 3 2M 上游引物5， —CTA TCC AGC GTA CTC CAA-3， (119nt 136nt) ， P 2M 下游引物5， -GCA GGC ATA CTC ATC TTT T-3， (342 nt 360nt)，扩 增片段长度242bp;(2) APRIL定量质粒标准品及0 2M定量质粒标准品的构建a) 标本收集及预处理收集对象晨起用清水漱口后，咳深部痰2 3 口于无菌痰盒内，用力振荡，混匀。痰内加入适量0. 1%二硫苏糖醇 解粘，振荡液化10 20min至痰中无粘稠痰块呈均匀液相后，用70ta尼 龙筛网过滤至10ml消毒玻璃管内，4。C1200rpm离心8min，弃上清，管 底沉淀物用1X磷酸盐缓冲液(PBS液)洗2遍，再用1XPBS液重悬， 制成细胞悬液，镜下计数细胞，调细胞悬液浓度至1X107mL， -70°C 冰冻保存，留作RNA提取用；b) 总RNA提取和逆转录取预处理后痰标本细胞悬液0.8mL加 lmLTrizol提取总RNA，取总RNA 0. 8 u g，以特异性抓尾引物Oligo (DT) |8 为引物逆转录为cDNA，分装后-2(TC保存；c) APRIL定量质粒标准品的构建取上述cDNA 1用APRIL上、 下游引物于PTC-200 PCR循环仪进行PCR扩增，反应条件为94。C 3min， 94°C 30s、 62°C 40s、 72。C30s， 33个循环，72。C延伸5min。 PCR产物 用胶回收试剂盒回收，回收产物与pGEM-T easy载体4。C连接12 16h，将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5 a ，涂布于经2%X-gal和20%IPTG 处理的含75 u g/ml氨苄青霉素的LB平皿上，37。C倒置培养12 16h， 经蓝白斑筛选，白色菌落经PCR初步鉴定后，阳性克隆进行测序分析， 将筛选出的阳性菌株扩增，抽提质粒，用核酸蛋白分析仪准确定量，并 进行10倍系列稀释作为标准品，分装后-2(TC保存；d) 32M定量质粒标准品的构建取上述cDNA 2ul，以PW上、 下游引物于PTC-200 PCR循环仪扩增目的片段，其余步骤同APRIL定量 质粒标准品的构建，得到IO倍系列稀释0 2M定量质粒标准品，分装后 -20。C保存；(3)痰中APRIL mRNA含量测定将待测痰液用与步骤(2)相同 的标本收集及预处理、总RNA提取和逆转录方法合成cDNA;将其中 2ulcDNA模板加入18 iil PCR反应液，所述PCR反应液中含1XPCR buffer, 4. 0画1/L MgCl2 , 0. 2腿ol/L dNTPs， APRIL上、下游引物各 0. 15 p mol/L， 20XSYBR Green I 0. 3 u 1 ， Taq DNA聚合酶1. 5U;混匀 后加入Roche专用毛细管中，并设立以水作模板的空白对照、以空载质 粒作模板的阴性对照和相应的6个浓度分别为109、 108、 107、 106、 105、 104copies/ml的质粒标准品，各反应管于Roche荧光定量检测仪进行 APRIL PCR扩增，扩增参数为94。C预变性3min; 94°C 5s， 62°C 35s， 86°C ls读取荧光度值，40个循环，测出待测样本中APRIL准确含量； 另将2 ii lcDNA模板加入18 u 1 PCR反应液，所述PCR反应液中含1XPCR buffer, 4. O腿ol/L MgCl2 ， 0. 2画1/L dNTPs， P 2M上、下游引物各 0. 15 ti mol/L， 20XSYBR Green I 0, 3 u 1 ， T叫DNA聚合酶1. 5U;混勻后加入Roche专用毛细管中，并设立以水作模板的空白对照、以空载质粒作模板的阴性对照和相应的6个浓度分别为109、 108、 107、 106、 105、 104COpies/ml的质粒标准品，各反应管于Roche荧光定量检测仪进行 P2M PCR扩增，扩增参数为.94。C预变性3min; 94°C 5s， 60°C 35s， 81°C ls读取荧光度值，40个循环；测出待测样本中6^准确含量。本专利技术准确可靠，可作为肺癌发生的有效检测指标。方法简便、易 操作。可为肺癌的临床诊断提供一种经济简便而有效可行的辅助手段。 下面结合附图和实例对本专利技术作进一步说明。附图说明图1是APRIL标准品测序图。图2是APRIL标准品2%琼脂糖凝胶电泳图。图3是PCR扩增产物电泳图。图4是肺癌组肺炎组正常组APRIL mRNA表达水平图。 图5是痰脱落细胞检查发现的鳞癌细胞图。图2中M:marker; 1 6:依次为3. 76X 109 3. 76X 104copies/ml APRIL标准品；B:空白对照。图3中M:marker; 1、 2:肺癌APRIL扩增片段;3、 4:肺炎APRIL扩增 片段;5、 6:正常对照APRIL扩增片段7 9:p2M扩增片段；IO:空白对照。图4中肺癌组分别与肺炎组和对照组比较P〈0.05， *肺炎组与对照组比较P〉0. 05。具体实施例方式一种，包括下列步骤(1) 引物合成依据Genebank收录人APRIL mRNA (注册号AF 046888)和^微球蛋白(32 microgluobulin， M) mRNA (注册号 NM004048)，用Primer Premier 5. 0软件设计引物，其中APRIL禾np2M 引物跨内含子，APRIL下游引物跨越327bp的第l个内含子，^M上游 引物跨越3811bp的第1个内含子。APRIL上游引物5， -ACT CTC A本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种痰中增殖诱导配体ｍＲＮＡ定量测定方法，其特征是：包括下列步骤： （１）引物合成：依据Ｇｅｎｅｂａｎｋ收录人ＡＰＲＩＬ ｍＲＮＡ和β↓［２］微球蛋白ｍＲＮＡ，用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计引物，其中ＡＰＲＩＬ和β↓［２］Ｍ引物跨内含子，ＡＰＲＩＬ下游引物跨越３２７ｂｐ的第１个内含子，β↓［２］Ｍ上游引物跨越３８１１ｂｐ的第１个内含子；ＡＰＲＩＬ上游引物：５’－ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＴＴ Ｇ－３’（８１９ｎｔ～８４０ｎｔ），ＡＰＲＩＬ下游引物：５’－ＧＧＡ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＣＴ Ｃ－３’（９８４ｎｔ～１００５ｎｔ），扩增片段长度１８７ｂｐ；β↓［２］Ｍ上游引物：５’－ＣＴＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＴＡ ＣＴＣ ＣＡＡ－３’（１１９ｎｔ～１３６ｎｔ），β↓［２］Ｍ下游引物：５’－ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ Ｔ－３’（３４２ｎｔ～３６０ｎｔ），扩增片段长度２４２ｂｐ； （２）ＡＰＲＩＬ定量质粒标准品及β↓［２］Ｍ定量质粒标准品的构建： ａ）标本收集及预处理：收集对象晨起用清水漱口后，咳深部痰２～３口于无菌痰盒内，用力振荡，混匀。痰内加入适量０．１％二硫苏糖醇解粘，振荡液化１０～２０ｍｉｎ至痰中无粘稠痰块呈均匀液相后，用７０μｍ尼龙筛网过滤至１０ｍｌ消毒玻璃管内，４℃１２００ｒｐｍ离心８ｍｉｎ，弃上清，管底沉淀物用１×磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ液）洗２遍，再用１×ＰＢＳ液重悬，制成细胞悬液，镜下计数细胞，调细胞悬液浓度至１×１０↑［６］／ｍＬ，－７０℃冰冻保存，留作ＲＮＡ提取用； ｂ）总ＲＮＡ提取和逆转录：取预处理后痰标本细胞悬液０．８ｍＬ加１ｍＬＴｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，取总ＲＮＡ０．８μｇ，以特异性抓尾引物Ｏｌｉｇｏ（ＤＴ）↓［１８］为引物逆转录为ｃＤＮＡ，分装后－２０℃保存； ｃ）ＡＰＲＩＬ定量质粒标准品的构建：取上述ｃＤＮＡ ２μｌ用ＡＰＲＩＬ上、下游引物于ＰＴＣ－２００ＰＣＲ循环仪进行ＰＣＲ扩增，反应条件为：９４℃３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ、６２℃４０ｓ、７２℃３０ｓ，３３个循环，７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用胶回收试剂盒回收，回收产物与ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体４℃连接１２～１６ｈ，将连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α，涂布于经２％Ｘ－ｇａｌ和２...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王惠民，孙宝兰，朱俐，丁伟峰，景蓉蓉，褚少朋，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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