本发明专利技术公开了属于化工原料的生物制备技术范围的一种氧化还原电势调控厌氧发酵生产１，３－丙二醇方法。它根据Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ发酵生产１，３－ＰＤ性厌氧的特性，在发酵体系中引入了ＯＲＰ电极。具体工艺过程包括菌种活化、种子培养和ＯＲＰ调控下的两段双底物集成发酵过渡过程而得到细胞干重最高达到２．１３ｇ／Ｌ，１，３－ＰＤ达到４５．１ｇ／Ｌ，主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸的好结果。本发明专利技术在与其它工艺同等生产水平时，生产时间缩短，对发酵体系的控制更加及时和精确，提高目标产物１，３－ＰＤ产量和产品的浓度、缩短发酵时间、降低发酵成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化工原料的生物制备技术范围，特别涉及一种氧化还原电势(ORP)调控厌氧发酵生产1，3-丙二醇方法。
技术介绍
1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，除象其他二元醇一样除用做溶剂外，主要用做合成聚酯、聚氨酯的单体，以1，3-PD为单体生产的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)是一种新型聚酯材料，具有易染色、弹性好、优良的柔软性、悬垂性、低静电、可生物降解等优点，主要用于生产纤维和纺织品，如地毯、袜裤、运动服等。PTT是目前合成纤维新品种开发的热点，由于其优良的特性，成为继PET、PBT后的又一种新型聚酯材料。据Shell公司预测，到2010年，包括非纤维应用在内的全球PTT需求量将达到一百万吨/年。另外，1，3-PD还可以用来合成清洁剂稳定剂、耐热容器、耐磨涂料、喷墨打印机墨水、光稳定聚酯、含酚树脂等。目前，工业上主要采用化学法合成1，3-PD，包括丙烯醛水合法、环氧乙烷法、环氧丙烷法等，其中德国Degussa公司的丙烯醛水合法、美国Shell公司的环氧乙烷法已投入工业化生产。化学合成法具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化剂、污染环境、原料不可再生等缺点，因此，各国都致力于开发生物法生产1，3-PD的技术。生物合成法的主要路线是在生物催化的作用下将甘油转化为1，3-PD。目前，自然界中能将甘油转化为1，3-PD的微生物有Klebsiella、Citrobacter、Clostridium、Ilyobacter、Lactobacillus、Enterobatcer，其中研究最多的是Klebsiella pneumoniae(克氏肺炎杆菌)、Citrobacter freundii(弗氏柠檬菌)和Clostridium butyricum(丁酸梭状芽孢菌)。克氏肺炎杆菌、丁酸梭状芽孢菌比弗氏柠檬菌具有较高的甘油耐受力，发酵速度较快。克氏肺炎杆菌与弗氏柠檬菌属于兼性厌氧菌，而丁酸梭状芽孢杆菌为严格厌氧菌。Biebl H，等人在文献“production of 1，3-propanediol Appl MicrobiolBiotechnol 1999，52289-297”中研究表明，甘油在微生物体内的厌氧过程主要有两条基本代谢途径氧化途径和还原途径。氧化途径主要包括步骤1)甘油经甘油脱氢酶(GDH)催化，生成2-羟基丙酮(DHA)，此酶为厌氧酶，以NAD+为辅酶；2)DHA在ATP及2-羟基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羟基丙酮(DHAP)；3)DHAP进一步代谢生成丙酮酸，然后通过乙酰CoA进入三羧酸循环或经过厌氧酵解生成其他小分子醇、酸等代谢产物。氧化途径生成生物能ATP和还原当量NADH2，并伴随着微生物细胞的生长。甘油的还原途径有两步酶反应1)甘油脱水酶(GDHt)在辅酶B12存在下将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)；2)在NADH2存在下，3-HPA在1，3-丙二醇脱氢酶(PDDH)催化下生成1，3-PD。还原途径消耗氧化途径生成的过量NADH2，使微生物细胞内的还原物质达到平衡。生物法生产1，3-PD目前存在产物浓度低、生产周期长和甘油转化率低等问题，导致缺乏市场竞争力而无法大规模应用。解决上述问题有两条途径，一条途径是S.Abbad-Andaloussi等人在文献“Isolation and characterization ofClostridium butyricum DSM 5431 with increased resistance to1，3-propanediol and altered production of acids，Appl.Environ.Microbiol.1995，614413-4417”中报导，利用菌种诱变技术和基因工程技术提高菌种的产物耐受能力和转化能力。另一条途径是Laffend，等在美国专利US 6025184中报导，采用连续、补料批式、反应分离耦合等培养方式消除底物抑制和产物抑制，并对发酵过程的重要参数进行有效地调控。为了提高1，3-PD的产量和产率，Zeng AP、杨东、Nemeth A等人在文献“Pathwayanalysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniaeregulation of reducing equivalent balance and product formation.Enzyme Microb Technol 1993，15770-779”、杨东，李春，杜晨字，张延平，曹竹安“两段双底物发酵生产1，3-丙二醇过程工程学报2003，3269-273”和“1，3-propanediol oxidoreductase production with Klebsiella pneumoniaeDSM2026 World J Microb Biot.2003，19659-663”中，各自开发了两段法生产1，3-PD的发酵工艺。Zeng AP等提出用两种菌耦合直接从葡萄糖生产1，3-PD的工艺，首先利用Osmotolerant yeast Pichia farinosa或者Escherichia coli重组菌从葡萄糖合成甘油，然后利用Klebsiella pneumoniae生产1，3-PD。其中第二个阶段1，3-PD的产率可以达到2.0g L-1h-1转化率为0.53g/g。杨东等开发了两段双底物发酵工艺，首先以葡萄糖和甘油为双底物进行好氧培养，通过控制葡萄糖和甘油的比例，使菌体只利用葡萄糖生长，通过甘油的存在诱导厌氧转化过程的相关酶。当菌体浓度达到一定浓度后，补加甘油同时通入氮气使发酵系统转入厌氧转化阶段，厌氧转化过程中通过流加甘油使甘油维持在一定范围内。1，3-PD的浓度达到50.16g L-1，产率为0.836g L-1h-1。Nemeth A等提出利用Klebsiella pneumoniae两步法发酵生产1，3-PD的工艺，通过好氧期培养，获得高浓度的菌体和甘油脱氢酶的酶活，然后转为厌氧工艺，最后得到1，3-PD的浓度为g L-1。修志龙等提出了Klebsiella pneumoniae微好氧发酵生产1，3-PD工艺，缩短了发酵周期，最终浓度，摩尔转化率和产率分别为59.50g/l，51.75％，and 1.57g L-1h-1。目前，1，3-PD的生产都是在厌氧条件下进行的，厌氧环境的监控对发酵过程起到重要的作用。对于两段法的工艺，由一个阶段到另一个阶段的过渡过程往往决定了后一个阶段(1，3-PD生产阶段)中菌体适应的时间和1，3-PD的产量。对于微耗氧工艺，由于发酵体系中氧气的浓度比较低，用溶氧电极检测不到发酵体系中微量氧气的变化，而通过氧气阀门的流量检测氧气通入的多少会由于气体压力的波动、流量计的精度等问题，会引起较大的误差。厌氧发酵具有悠久的历史，至今在工业生产上仍然广泛的应用在乳酸、丙酮、乙醇、甘油等化工产品的生产上。除了1，3-PD生物法生产外，厌氧、兼性厌氧发酵工艺还在废水处理、生物制氢和生物柴油等领域具有重要的研究价值。但长期以来，由于厌氧发酵过程缺少合适的发酵状态指示本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种氧化还原电势调控厌氧发酵生产１，３－丙二醇方法，其特征在于：根据Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ发酵生产１，３－ＰＤ性厌氧的特性，在发酵体系中引入了ＯＲＰ电极，对发酵体系的ＯＲＰ进行调节，并根据前期实验测定厌氧发酵过程中ＯＲ Ｐ变化的规律及ＯＲＰ的影响，调控ＯＲＰ以提高目标产物１，３－ＰＤ产量、缩短发酵时间为准；具体实施工艺是利用ＯＲＰ调控克氏肺炎杆菌厌氧合成１，３－丙二醇工艺，其实施步骤如下：菌种：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ； 步骤１：菌种活化由菌种保藏斜面挑取一环Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌苔接入ＬＢ固体培养基进行活化，在３０－４０℃下培养２０－３０小时后，再挑取一环菌苔接入固体ＬＢ平板，３５－４０℃培养２４小时后获得单菌落；步 骤２：种子培养从步骤１的ＬＢ平板上挑取一个单菌落，接入２５０ｍｌ摇瓶培养，装种子培养基液量５０ｍｌ，在３０－４０℃，２００ｒｐｍ下，培养８－１０小时；步骤３：两段双底物集成发酵好氧过程装有２Ｌ预先灭菌的集成发酵培养基 ，将步骤２的种子液接入发酵罐中，ＯＲＰ电极在紫外灯下照射２小时表面灭菌，再加入电极前用酒精棉球轻轻擦洗表面，在无菌间中用无菌风吹干后，将ＯＲＰ电极放入发酵罐中，好氧培养过程条件，３５－４０℃，４００ｒｐｍ，空气流量２．０Ｌ／ｍｉｎ，以４Ｎ ＮａＯＨ控制ｐＨ值为７，好氧过程在２－３小时，此时ＯＲＰ为－７０～＋７０之间，因培养基组分以及灭菌条件不同而不同；步骤４：ＯＲＰ调控下的两段双底物集成发酵过渡过程过渡过程是指由好氧过程转为厌氧过程的初始阶段，这一阶段没有１ ，３－丙二醇生成，当菌体浓度（ＯＤ）达到１～２之间（即细胞干重达到０．２５～０．５ｇ／Ｌ之间）时，补加甘油至２０ｇ／Ｌ，减少空气通入量，并开始通入氮气，开始调控ＯＲＰ，通入氮气后，ＯＲＰ由初始迅速下降到－４００ｍＶ以下，按体积比调节空气和氮气的比例（１～２０）∶（２０～１）和总流量０．０５－６Ｌ／ｍｉｎ，使得ＯＲＰ稳定到－３５０ｍＶ；过渡过程工艺条件：３５－４０℃，４００ｒｐｍ，以４ＮＮａＯＨ控制ｐＨ值为７，过渡过程时间为４－７小时；步骤５：多次ＯＲＰ调控下的两段 双底物集成发酵厌氧转化过程厌氧转化过程指开始１，３－丙二醇生成的过程，转化过程工艺条件：３５－３７℃，４００ｒｐｍ，在发酵体系...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘铭，杜晨宇，曹竹安，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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