筛选未知有机体的方法技术

筛选含有核酸的样品以确定其核苷酸序列未知之有机体的存在的方法，包括下列步骤：对样品中所有核酸进行测序；该测序步骤所得到的核苷酸序列与已知有机体的核苷酸序列相比较；鉴定与已知核苷酸序列不对应的核苷酸序列的连续区域；和，确定所述核苷酸序列之连续区域是其核苷酸序列未知之有机体的核苷酸序列。２．根据权利要求１的方法，其中所述测序步骤包括通过与已知序列的探针杂交来测序核酸序列的步骤。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的领域本专利技术一般涉及筛选有机体之核酸的方法，其核酸的核苷酸序列是未知的，本专利技术尤其涉及应用核苷酸的测序来鉴定有机体的方法。背景核苷酸的测序方法提供了不同丰度的序列信息。从核苷酸测序所得到的信息，可以用作测定有机体基因组的一级序列信息的来源，并且一旦弄清楚其核苷酸序列，就可作为表达所测序之基因和诊断含有所测序基因之有机体的基础。然而，还有核苷酸测序的其他用途的预期优点，它们不需要待测序有机体方面的知识。本专利技术的概要本专利技术提供一种筛选含有核酸之样品的方法，以确定其核苷酸序列未知的有机体的存在，该方法包括测定样品中的所有核酸的序列，由测序步骤中获得的核苷酸的序列与已知有机体的核苷酸序列进行比较；鉴定与已知核苷酸序列不对应之核苷酸序列的连续区域；和确定所述核苷酸序列的连续区域是其核苷酸序列未知的有机体的核苷酸序列。按照本专利技术的方法可以包括测序步骤，包括通过与已知序列的探针杂交来测序核酸的步骤。本专利技术的优选方法包括确定步骤，包括构建一寡核苷酸探针的步骤，所述寡核苷酸探针具有存在于未知序列而不存在于已知序列中的连续核苷酸序列或其互补物；在严格杂交的条件下将标记的寡核苷酸探针暴露于怀疑含有这种寡核苷酸序列的样品；并鉴定样品中标记的寡核苷酸探针和核酸之间是否存在先前杂交复合物。严格杂交条件是本领域内所了解的那些导致探针与完全配对但不错配的核苷酸序列进行杂交的条件。按照本专利技术的方法可进一步包括第二比较步骤，其中核苷酸序列的第二连续区域与已知的核苷酸序列相比较。按照本专利技术的确定步骤可含有如下步骤在严格杂交条件下将样品暴露于与未知核苷酸序列部分互补但不与已知核苷酸序列互补的寡核苷酸探针；和将含有与标记寡核苷酸杂交的核酸组分与样品的其他组分相分离。根据本专利技术的方法可进一步包括显微镜检查含有标记的寡核苷酸探针组分的步骤，将含有标记的寡核苷酸探针之组分中的核酸测序，和/或第二暴露步骤，其中在严格杂交条件下将标记的寡核苷酸探针暴露于第二样品。根据本专利技术的方法可包括第二个暴露步骤，此步骤含有从第二个体得到样品或从同一个体得到的第二样品的步骤。详细的描述用于分离和克隆这种核苷酸测序的核酸和方法是本领域专业技术人员熟知的。例如参见Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.1-2，John Wiley&Sons Publs.(1989)；和Sambrook等人，Molecular Coning A LaboratoryManual，第二版，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Press(1989)，这两篇文献均并入本文作为参考。杂交测序(“SBH”)是一种可由本领域技术人员熟知的很多方法实施的发展得很成熟的技术。特别是下列涉及杂交测序技术的文献并入本文作为参考Drmanac等人，U.S.专利No.5,202,231-1993年4月13日公开Drmanac等人，Genomics，4，114-128(1989)；Drmanac，等人Proceedings of the First Int′1.Conf.Electrophoresis Supercomputing Human Genome Cantor，DR&Lim HA eds，World Scientific Pub.Co.，Singpore，47-59(1991)；Drmanac et al.，Science，260，1649-1652(1993)；Lehrach et al.，GenomeAnalysisGenetic and Physical Mapping，1，39-81(1990)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Drmanacet al.，Nucl.Acids Res.，4691(1986)；Stevanovic etal.，Gene，79，139(1989)； Panuesku et al.，Mol.Biol.Evol.，1，607(1990)；Drmanac et al.，DNA and/Cell Biol.，9，527(1990)；Nizetic et al.，Nucl.Acids Res.，19，182(1991)；Drmanac et al.，J.Biomol.Struct.Dyn.，5，1085(1991)；Hoheisel etal.，Mol.Gen.，4，125-132(1991)；Strezoska et al.，Proc.Nat′1.Acad.Sci.(USA)，88，10089(1991)；Drmanac et al.，Nucl.Acids Res.，19，5839(1991)；and Drmanac et al.，Int.J.Genome Res.，1，59-79(1992)。人们可应用SBH技术，得到已知有机体的全部或部分基因组之核苷酸序列的信息。在此方法中，很多已知长度的寡核苷酸探针(有些可达7个单体)，在杂交的条件下，分别暴露在待测序的样品中。人们可以应用不到总数的已知长度的可能的探针，来进行各种技术试验，并且可以应用不只一种长度的探针在杂交条件下暴露，以改进这些结果。SBH技术可与凝胶测序一起，以获得一种未知样品序列的全部信息。根据本专利技术，SBH技术可应用于核酸样品，以测定得自于一种未知核苷酸序列的有机体的样品中是否含有核酸。优选的样品可含有一个以上的基因组。样品中的核酸得到的核苷酸序列，可与可被排除考虑的已知有机体基因组的核苷酸序列相比。从一种样品得到的连续核苷酸序列，其序列与已知有机体的任何已知核苷酸序列均不相对应，由此鉴定存在以前未知的有机体。通过SBH技术得到先前未知的有机体的核苷酸序列，然后制成标记的寡核苷酸探针，以断定有机体是否存在，并且作为鉴定和分离先前未知的有机体的手段。可以应用诸如过滤、离心和色谱技术来将这种有机体与另一些已知有机体分离开。可以应用标记寡核苷酸探针作为标志，以鉴定分离组分中先前未知有机体的存在，从而得到纯化的有机体样品。为了验证先前有关未知的有机体存在的最初测定，并且为了证实得到此有机体的核苷酸序列，不管愿望圆满程度如何，都可测序此有机体的这些纯化样品。用SBH技术对先前未知的有机体进行鉴定也可以用于确定致病有机体的诊断过程中。同样，本专利技术的方法可用以鉴定诸如土壤、空气和水的样品中的新有机体。人们可用这一测定来筛选具有从土壤、空气或水的样品所观察到的合意或不合意作用的有机体(例如污染物的降解或硝化作用)。同样，通过应用本专利技术的方法可以检测在食物中具有有益或有害作用的有机体。例如，若有一种合意的表型，通过SBH技术可鉴定出具有合意性质的微生物，甚至在样品中存在合意表型的情况下，用根据SBH技术为基础构建的标记探针进行杂交的相关存在，将未知有机体从混合物中分出。实施例从显出疾病症状的患者抽取血样，按照本专利技术来筛选。将怀疑含有可能引起疾病症状的微生物的血样组分预先处理，得到具有筛选用途的cDNA文库。这种制备可以包括载体DNA的克隆和通过PCR技术来扩增克隆的核酸。在SBH方法应用之后，得到序列的信息。此序列的信息是代表寡核苷酸探针的核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：L·S·格卢伯，
申请(专利权)人：希斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：