在低浓度游离氨基酸下生产棒酸的发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种通过链霉菌属的发酵产生次级代谢产物的方法。如果将游离氨基酸浓度保持在低水平，则可获得出人意料地高产量。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在含有碳源和氮源的适当培养基上，由链霉菌属的菌株发酵生产次级代谢产物的领域。
技术介绍
链霉菌属的微生物发酵产生大量的多种不同的次级代谢产物，例如β-内酰胺类、聚酮类化合物以及大环内酯类，如棒酸、匹马菌素和红霉素。棒酸是重要的β-内酰胺酶抑制剂，由属于链霉菌属的多种微生物菌株产生，诸如带小棒链霉菌(S.clavuligerus) ATCC 27064、S.jumonjinensis(英国专利1563103)、桂滨链霉菌(S.katsurahamanus)IFO13716 FERM 3944(日本专利83009679B)和链霉菌属的株P6621 FERM2804(日本专利申请55162993A)。已经能够大量生产棒酸，并且生产条件正在进行不断的优化，以便提高产量及终产物的纯度。已经进行了关于连续发酵(GB 1508977)、对分批工艺中碳的补料(EP-182522)、低浓度氨的维持(WO 96/18743和Romero J.，Liras P.和Martin J.F.，应用微生物学和生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1984)，第20卷，318-325)、生长和生产期间发酵培养基中磷酸盐浓度的降低(Romero(1984)，参见上文，Lebrihi A.，Germain P.和Lefebre G.，应用微生物学和生物技术(1987)，第26卷，130-135和国际专利申请WO 97/19187和WO 97/39137)方面的棒酸生产的优化。就碳源而言，已知与甘油相比甘油三酯类是优选的碳源(Butterworth(1984)；工业抗生素生物技术(Biotecnology of Industrialantibiotics)，E.J.Vandamme，第一版，Marcel Dekker公司225-235页和专利申请WO 97/19187)。就氮源而言，Brana A.F.，Paiva N.和Demain A.L.已经进行了大量研究，普通微生物学杂志(J.of General Microbiology(1986)，第132卷，1305-1317。已发现在含有一种氨基酸的培养基上的生长比以氨作为唯一氮源的生长迅速。而且，在含有氨作为唯一氮源的培养基上，最大比生长速率小于每小时0.05，Brana(1986)参见上文，以及Aharonowitz Y.和Demain A.L.加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)(1979)，第25卷，61-67，而在含有至少一种氨基酸(如，天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、苏氨酸或者精氨酸)的培养基中，最大比生长速率大于每小时0.05。因此，优选使用含有一种或者多种氨基酸的培养基。与只含有氨的无机培养基相比，在这种培养基中生物量的生产花费的时间较少，这理所当然比较慢的生产工艺更具有优势。在未预先公开的国际申请WO 98/37179中描述了精氨酸是棒酸生产以及头孢菌素生产的(例如来自带小棒链霉菌的头孢霉素C)发酵配料(Aharonowitz y.和Demain A.L.，参见上文)。除此之外，在分批工艺中谷氨酸抑制棒酸的形成(Romero(1984)，参见上文)，所以不能够直接使用谷氨酸或谷氨酰胺。而且，甚至更为普遍的是使用蛋白质作为氨基酸的来源，因为这比使用单个氨基酸便宜得多。显而易见的缺点是蛋白质的不均一性，以及一般与这些复合营养物相关的不可再现的质量。棒酸生产所使用的典型复合氮源是用于带小棒链霉菌(EP 0 182 522 B1和WO 97/19187)的鱼粉、大豆粉、花生粉，用于S.jumonjinensis(英国专利1563103)的大豆粉，用于链霉菌的种P6621 FERM 2804(WO 97/39137+日本专利申请55162993)的大豆粉和玉米浆，以及用于桂滨链霉菌(日本专利83009679B)的大豆粉和棉籽粉。在一篇综述文章中，报道了大豆蛋白质是棒酸生产最重要的蛋白质(Butterworth(1984)，参见上文)。此处，我们描述在产生次级代谢产物的链霉菌属的发酵液中，优选富含谷氨酸和脯氨酸的水解蛋白质的令人惊奇的有利应用，以及谷蛋白水解产物与酪蛋白水解产物在这个方面的特定优势。另外，我们还描述了使用特定的氨基酸来源(尤其是将谷氨酸)作为生产这些化合物的分批-补料工艺中的补料营养物质的出乎意料的有利应用。附图描述附图说明图1低水平游离谷氨酸下分批发酵中棒酸的效价。图2低水平游离谷氨酸下分批-补料(fed-batch)发酵中棒酸的效价。专利技术概述本专利技术提供了一种通过将一种能产生次级代谢产物的链霉菌属菌株在适当的培养基上发酵来生产次级代谢产物的方法，方法是将游离氨基酸浓度维持在低于5克/升发酵液，优选地，低于2.5克/升，更优选地，低于0.5克/升发酵液来产生次级代谢产物，前提是排除了向带小棒链霉菌发酵液中加入4g/L浓度游离天冬氨酸的情况。这种工艺尤其有利于生产β-内酰胺类、聚酮类化合物以及大环内酯类，优选地，棒酸、匹马菌素、红霉素、制霉菌素或两性霉素。根据本专利技术的一个方面，以分批-补料或者连续方式应用一种或者多种氨基酸，优选谷氨酸或者脯氨酸以在发酵液中维持这样低的浓度。根据本专利技术的另一个方面，除氨基酸本身以外，还可以分批、分批-补料、半连续或者连续方式加入蛋白质水解产物，更优选地，谷蛋白水解产物或者酪蛋白水解产物，最优选地小麦谷蛋白水解产物。专利技术详述本专利技术描述通过以分批-补料或者连续方式应用所述氨基酸或者通过以任一方式应用蛋白质水解产物的方法利用缺乏游离氨基酸的培养基。本专利技术的申请中，将蛋白质定义为具有用分子量大于20,000道尔顿来表示其大小的氨基酸多聚体，它没有经过任何方式的将蛋白质降解成较小片段的加工。将蛋白质水解产物定义为具有平均大小在300至20,000道尔顿之间的氨基酸多聚体，并且游离的氨基酸含量低于总氨基酸的30％。这些蛋白质水解产物可通过相应蛋白质的酶促水解或化学水解而产生。或者通过在工艺中采用非水解蛋白质作为原料，采用增强了蛋白酶活性的菌株来实现使用水解蛋白质的优势。而且，在本申请中，谷氨酸代表glutam类化合物，例如谷氨酸和谷氨酰胺。本申请中，将蛋白质提取物定义为具有低于300道尔顿分子量的蛋白质水解产物，并且其中30％以上的氨基酸以游离氨基酸存在。当某种蛋白质或者其水解产物被定义为富含谷氨酸时，这就意味着大于15％的氨基酸成分是由谷氨酸和谷氨酰胺组成。所描述的富含谷氨酸的蛋白质是酪蛋白(21％)和小麦谷蛋白(35％)。根据本专利技术的一个方面，令人惊奇地发现当培养基中含有蛋白质水解产物时，尤其是所述水解产物来源于小麦谷蛋白或者酪蛋白时，棒酸的产量非常高。因为当使用其它蛋白质来源如酵母和玉米的蛋白质提取物时，尤其是在与肽(＜30％游离氨基酸)相比高水解度(35％)时，生产水平大大地下降，这表明蛋白质水解产物应该优选地含有低于30％的游离氨基酸，甚至更优选地，低于5％的游离氨基酸，最优选地低于1％的游离氨基酸。可以任何加料形式，即分批、分批-补料、连续或者半连续形式，使用和补加优选地富含谷氨酸的蛋白质水解产物。半连续加料是指连续向发酵液中加入营养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在含有碳源和氮源的适当培养基上通过链霉菌属菌株的发酵生产次级代谢产物的方法，其中将供给产生次级代谢产物的链霉菌属的游离氨基酸浓度保持在低于５克／升发酵液，更优选地低于２．５克／升，最优选地低于０．５克／升，前提是排除了带小棒链霉菌发酵液之浓度为４克／升游离天冬氨酸的情况。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：WTAM德拉阿特，P克拉本，
申请(专利权)人：DSM公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]