偃麦草钠离子反向转运蛋白基因及其克隆方法与应用技术

本发明专利技术涉及偃麦草中Ｎａ＃＋［＋］反向转运蛋白ＥＮＨＸ１基因的克隆、重组及耐盐性功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。从偃麦草根中提取总ＲＮＡ，然后将２微克总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ。根据其它植物中的Ｎａ＃＋［＋］反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物，进行常规聚合酶链式反应（ＰＣＲ），ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，转化ＤＨ５α细胞，进行序列测定。然后进行３′和５′末端快速扩增获得全长的ｃＤＮＡ。进一步构建正义表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥具较高的耐盐性。因此，该基因转化小麦、水稻、玉米等作物，将会提高这些植物的耐盐性，将使得这些植物可以在盐碱地上种植，具有非常重要的经济效益和社会效益。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及偃麦草中Na+反向转运蛋白ENHX1基因的克隆、重组及耐盐性功能的分析及应用，属于分子生物学和生物
由于Na+反向转运蛋白基因在耐盐过程中所起的作用，本专利技术人从耐盐植物偃麦草中分离编码Na+反向转运蛋白的基因。根据其它植物中发表的Na+反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从耐盐植物偃麦草中分离出编码质膜上的Na+反向转运蛋白基因。进一步构建正义表达载体，转化模式植物拟南芥，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
技术实现思路
本专利技术首次从耐盐植物偃麦草中分离出编码Na+反向转运蛋白的全长的cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，获得的转基因植株耐盐性高达200mM。从偃麦草根中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na+反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物正向引物5′-CA(CT)TA(CT)AC(CT)TGGCA(CT)AA(CT)GT-3′反向引物5′-CAT(GC)AG(ACT)CC(AGT)GCCCACCA(AGT)AT-3′进行常规聚合酶链式反应(PCR)，取2μl PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。具体的PCR试剂与条件为10×反应缓冲液 5μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA4μlTaqDNA聚合酶0.5μl总体积 50μlPCR反应条件为94℃ 3分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。结果扩增到一个DNA片段。取2μlPCR产物连接到pGEM-T载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取菌斑，提取质粒DNA，用于序列测定。经过3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA为1955bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1638bp，由此推得具546个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，表明与已发表的小麦、水稻和拟南芥的Na+反向转运蛋白相比，氨基酸同源性分别为87％、60％和58％，表明经过上述克隆步骤得到了编码Na+反向转运蛋白的基因。该基因序列如下序列表(1)SEQ ID NO1的信息(a)序列特征*长度1955碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源偃麦草(f)序列描述 SEQ IN NO.11ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-6061 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-10201021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-10801081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-11401141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-12001201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-12601261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-13201321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-13801381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-14401441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-1500150本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克隆的偃麦草Ｎａ↑［＋］反向转运蛋白基因ＥＮＨＸ１，其特征在于它具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １所示的序列，（ａ）序列特征＊长度：１９５５碱基对＊类型：核酸＊链型：双链＊拓扑结构：线性（ｂ）分子类型：ｃＤＮＡ（ｃ） 假设：否（ｄ）反义：否（ｅ）最初来源：偃麦草（ｆ）序列描述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１ ＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧ ＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧ ＧＣＡＴＧＧＧＧＣＴ ＣＧＡＴＴＴＧＧＧＡ ＧＣＣＡＴＣＧＣＴＣ ＴＣＡＡＧＴＡＣＡＣ－６０ ６１ ＧＧＧＧＣＴＧＧＣＧ ＧＴＧＴＣＧＧＡＣＣ ＡＣＧＧＣＴＣＣＡＴ ＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣ ＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡ ＴＣＧＣＧＣＴＧＣＴ－１２０１２１ ＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣ ＡＴＴＧＴＣＴＴＣＧ ＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴ ＣＧＡＧＧＧＧＡ ＡＣ ＣＧＣＴＧＧＧＴＣＡ ＡＴＧＡＧＴＣＣＡＣ－１８０１８１ ＣＡＣＣＧＣＧＣＴＴ ＧＴＣＣＴＧＧＧＧＣ ＴＣＡＴＣＡＣＣＧＧ ＴＧＧＴＧＴＧＡＴＴ ＣＴＧＡＴＣＴＧＣＴ ＣＣＡＡＡＧＧＧＧＴ－２４０２４１ ＧＡＡＴＴＣＧＣＧＣ ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＴ ＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡ ＴＡＴＴＴＴＣＴＴＣ ＡＴＣＴＡＣＴＴＧＣ ＴＣＣＣＧＣＣＣＡＴ－３００３０１ ＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣ ＧＣＣＧＧＧＴＴＴＣ ＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡ ＡＡＡＧＣＡＡＴＴＣ ＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴ Ｔ ＴＧＣＧＡＣＡＡＴ－３６０３６１ ＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴ ＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧ ＧＡＡＣＡＴＴＧＡＴ ＡＴＣＣＴＴＴＧＴＡ ＡＴＡＡＴＣＡＣＧＴ ＴＣＧＧＴＧＣＴＡＴ－４２０４２１ ＧＧＧＡＴＴＧＴＴＣ ＡＧＣＡＡＡＣＴＴＧ ＧＴＧＴ ＴＧＧＴＣＣ ＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴ ＧＧＧＧＡＣＴＡＴＣ ＴＴＧＣＡＡＴＴＧＧ－４８０４８１ ＧＧＣＴＡＴＣＴＴＣ ＴＣＡＧＣＡＡＣＡＧ ＡＴＴＣＴＧＴＴＴＧ ＣＡＣＣＴＴＡＣＧＧ ＧＴＧＣＴＴＡＡＣＣ ＡＧＧＡＴＧＡＡＧＣ－５４０ ５４１ ＡＣＣＣＣＴＡＣＴＣ ＴＡＴＡＧＴＣＴＡＧ ＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡ ＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴ ＡＡＴＧＡＴＧＣＴＡ ＣＡＴＣＡＧＴＴＧＴ－６００６０１ ＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴ ＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡ ＡＣＡＴＴＧＡＴＡＴ ＴＡＡＴＣＡＴＴ ＴＴ ＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧ ＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡ－６６０６６１ ＡＴＴＣＡＴＴＧＧＡ ＡＡＡＴＴＣＣＴＣＴ ＡＣＣＴＡＴＴＣＴ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张宪省，乔卫华，李兴国，李全梓，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]