石斑鱼胰岛素样生长因子I基因及含有该基因的载体和重组株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种石斑鱼胰岛素样生长因子Ⅰ基因，该基因是以石斑鱼肝脏总ＲＮＡ为模板，经ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＡＣＥ方法而得到的具有石斑鱼胰岛素样生长因子Ⅰ基因全长ｃＤＮＡ序列的基因片段；本发明专利技术还构建了含该基因的载体和重组株；利用本发明专利技术可以获得来源稳定、成本便宜的石斑鱼胰岛素样生长因子Ⅰ重组蛋白，并进一步制备适合海水鱼类使用的促鱼生长剂或添加剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于基因工程
，特别是一种石斑鱼胰岛素样生长因子I基因及含有该基因的载体和重组株，以及该重组蛋白在制备适合海水鱼类使用的促鱼生长剂或添加剂中的应用。
技术介绍
胰岛素样生长因子I(Insulin-like growth factor-I)是一种由70个氨基酸组成的蛋白质，由于其结构与胰岛素原(proinsulin)相似，故和胰岛素(insulin，INS)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、松弛素(relaxin)一起被称为INS/IGF/relaxin家族蛋白，IGF-I具有调节细胞代谢、促进细胞生长、分化和分裂、抑制细胞死亡、调节多种细胞功能的作用。生长激素(GH)的促生长效应主要就是由IGF-I介导的，因此IGF-I也曾被称作生长素介质C(somatomedin C)，IGF-I在出生后的生长发育中起着重要作用。由于IGF-I在鱼类生长、繁殖及渗透压调节等多方面有着极其重要的作用，国外许多学者建立了转基因动物模型过量表达IGF-I基因，IGF-I转基因动物的生长率表现了轻度(约30％)的增加。近年来随着鱼类IGF-I研究的进一步深入，无论是IGF-I生物活性的检测和研究，还是建立IGF-I放射免疫测定法，放射受体测定法，或者是ELISA等都需要足够量鱼类IGF-I蛋白。许多学者曾试图从鱼的血浆或组织中提纯天然的IGF-I蛋白都无功而返，现在国外已有公司开始大规模生产基因重组鱼IGF-I蛋白，但尚未有斜带石斑鱼的IGF-I蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因；本专利技术的另一目的在于提供含有该基因的载体，特别是克隆载体和表达载体；本专利技术的另一目的在于提供上述载体转化的微生物菌株；本专利技术的另一目的在于提供上述重组蛋白在制备适合海水鱼类使用的促鱼生长剂或添加剂中的应用。氨基酸序列分析表明斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I成熟肽是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I原的一个内片段，相当于斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I原第45位至112位氨基酸序列，即B-C-A-D区域，共68个氨基酸。胰岛素样生长因子I原在加工过程中经蛋白水解酶切除后产生这一区段，具有促进生长、繁殖和调节渗透压的生物活性，而完整的胰岛素样生长因子I原并不具有这一活性。本专利技术的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I全长基因是以斜带石斑鱼肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR和RACE方法扩增而得到的，它来源于斜带石斑鱼肝脏cDNA上的胰岛素样生长因子I结构域所对应的基因全长片段。本专利技术用于表达斜带石斑鱼IGF-I重组蛋白的IGF-I成熟肽基因序列是以斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I全长基因的B-C-A-D区域所对应的基因片段。按照上述的斜带石斑鱼IGF-I重组蛋白的IGF-I成熟肽基因序列，它最好是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I全长基因394bp至597bp(相当于45位至112位氨基酸)的片段，其氨基酸序列及其所编码的氨基酸序列如序列表所示。本专利技术还构建了含有上述斜带石斑鱼IGF-I重组蛋白的IGF-I成熟肽基因序列的载体；特别是含有该基因的大肠杆菌克隆载体以及表达载体。这些载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的相应载体的相应酶切位点之间，即构建成所需的含有斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因的表达载体。上述含斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因的大肠杆菌表达载体优选由本专利技术合成的斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因与大肠杆菌表达载体pRSET构建成的重组表达载体，命名为pRSET-IGF-I。本专利技术还用上述含有斜带石斑鱼IGF-I基因的相应表达载体分别构建了能高效表达斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因的大肠杆菌重组株。本专利技术的上述能表达斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I大肠杆菌重组菌株优选由含有斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因的表达载体pRSET-IGF-I转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为Escherichia coliBL21(pRSET-IGF-I)，简称Ecoli BL21(pRSET-IGF-I)。斜带石斑鱼具有重大的经济价值，本专利技术利用基因工程技术生产重组斜带石斑鱼IGF-I蛋白，并能进一步用作制备促鱼生长剂或添加剂。附图说明图1和图2是以斜带石斑鱼肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板的胰岛素样生长因子I基因中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图；图3是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因3’RACE操作流程图；图4是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因3’端片段合成的第一次PCR凝胶电泳分析图；图5是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因3’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；图6是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因3’端片段合成的第三次PCR凝胶电泳分析图；图7是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因5’RACE操作流程图；图8是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因5’端片段合成的第一次PCR凝胶电泳分析图；图9是斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因5’端片段合成的第二次PCR凝胶电泳分析图；其中1.分子量标准；2.PCR产物；3.pGEM-T-easy vector；4.pGEM-T-IGF-I-clone/EcoRI。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术作进一步说明，但不以任何形式限制本专利技术。实施例1斜带石斑鱼胰岛素样生长因子I基因中间片段的合成根据已发表的人和各种动物的胰岛素样生长因子I的cDNA序列的同源性比较结果，以与斜带石斑鱼亲缘性最近的黑鲷的cDNA全序列为引物设计模板，设计合成一套嵌套简并引物，共有两条上游引物和一条下游引物。第一条上游引物(PF1)是从第259位碱基起20个碱基5’-CCACACCCTCTCACT(A/G)(C/G/T)TGC，第二条上游引物(PF2)是从第369位碱基起23个碱基5’-GTGGAGA(G/C)AG(A/G)GG(C/G/A)TTTTATTTC，下游引物(PR1)是从第708位碱基起20个碱基5’-CG(A/G)CT(T/C)GAGTT(T/C)TTC(G/T)GATG。第一次PCR以斜带石斑鱼肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增原第259位至708位的核苷酸序列，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为3个循环95℃变性30秒，80℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。第二次PCR以第一次PCR产物为模板，经PCR方法扩增原第369位至708位的核苷酸序列，反应条件为95℃预变性5分钟；下边为3个循环95℃变性30秒，80℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃延伸7分钟。两次PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1和图2。从图1可见第一次PCR扩增了一段长约450bp的序列，而图2可见第二次扩增了一段长约340bp的序列。将340bp的扩增产物连接到pGEM-T-easy载体上得到重组质粒pGEM-T-IGF-I-Clone。将重组质粒pGEM-T-IGF-I-Clone用pGEM-T-easy的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石斑鱼胰岛素样生长因子Ⅰ基因，基因序列及氨基酸序列如序列表所示。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：李文笙，石锋涛，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]