含促调亡蛋白质的治疗剂制造技术

本发明专利技术涉及用嵌合多肽靶向杀伤细胞，嵌合多肽包括细胞－特异的靶向部分和信号转导途径因子。在一个较佳实施方案中，信号转导途径因子是细胞凋亡诱导因子，如粒酶Ｂ、粒酶Ａ或Ｂａｘ。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术针对细胞生物学和分子生物学及癌生物学的领域。更具体的是，本专利技术提供涉及治疗剂的方法和组合物，治疗剂包括促凋亡部分和细胞-特异的靶向部分。专利技术的背景选择性破坏单个细胞通常在多种临床情况中是需要的。细胞中多种信号转导途径与细胞死亡和存活相连，途经的限制性和/或关键成分的传递可根据其破坏产生。这种信号转导途径的一个经典例子是细胞凋亡，多种细胞凋亡途径的因子可用于靶向死亡细胞。细胞凋亡或细胞程序性死亡是控制正常组织稳态的一个基本过程，这是通过调节细胞增殖和死亡间的平衡(Vaux等，1994；Jacobson等，1997)。丝氨酸蛋白酶粒酶B(GrB)(Lob等，1986；Schmid和Weissman，1987；Trapani等，1988)整体参与凋亡细胞死亡，靶细胞中的细胞死亡通过细胞暴露于溶酶体样胞质颗粒(或溶细胞颗粒)的内含物来诱导，这种颗粒发现于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和天然杀伤(NK)细胞中(Henkart，1985；Young和Cohn，1986；Smyth和Trapani，1985)。细胞毒性淋巴细胞颗粒包含穿孔素、成孔蛋白质和定义为粒酶的丝氨酸蛋白酶家族(表1)。穿孔素的一些结构和功能类似于补体蛋白质C6、C7、C8和C9、补体攻膜复合体的成员(Shinkai等，1988)。在淋巴细胞-介导的细胞溶解中，穿孔素插入靶细胞膜并表现出聚合以形成孔(Podack，1992；Yagita等，1992)，这介导粒酶B进入靶细胞的细胞质。一旦进入，粒酶B通过直接活化胱冬酶和引起DNA迅速断裂来诱导细胞凋亡(Shi等，1992)。表1粒酶(淋巴细胞丝氨酸蛋白酶) 粒酶结构相关，但有不同优选底物。粒酶B通过其在天冬氨酸残基后裂解的独特能力可体外裂解许多胱冬酶原(procaspase)，它是分析胱冬酶-3(Darmon等，1995；Quan等，1996；Martin等，1996)、胱冬酶-7(Chinnaiyan等，1996；Gu等，1996；Fernandes-Alnemri等，1995)、胱冬酶-6(Orth等，1996；Fernandes-Alnemri等，1995)、胱冬酶-8(Muzio等，1996)、胱冬酶-9(Duan等，1996)和胱冬酶-10a/b(Fernandes-Alnemri等，1996；Vincenz和Dixit，1997)成熟的一个重要工具。此外，它对靶细胞有高毒性(Shi等，1992)。到目前为止假定粒酶B通过直接活化胱冬酶杀伤细胞，在一些情况下通过直接破坏下游胱冬酶底物来补充(Andrade等，1998)。进入细胞溶胶后，粒酶B迅速转位到核(Jans等，1996；Trapani等，1996)并可裂解多(ADP-核糖)聚合酶和核基质抗原，有时用与胱冬酶优选不同的裂解位点(Andrade等，1998)。尽管许多胱冬酶原在体外有效裂解，粒酶B诱导的胱冬酶活化以等级方式在完整细胞中发生，在处决者胱冬酶如胱冬酶-3水平开始，接着是胱冬酶-7(Yang等，1998)。这与FasL-介导的杀伤相反，FasL-介导的杀伤依赖顶端胱冬酶如胱冬酶-8产生的膜信号(Muzio等，1996；Sarin等，1997)。此外，一些研究显示粒酶B也可通过不依赖胱冬酶的机制诱导死亡，包括直接破坏非核结构，尽管此途径中的关键底物尚未阐明(Sarin等，1997；Trapani等，1998；Heibein等，1999；Beresford等，1999)。Froelich和同事的研究表明GrB通过受体-介导的内吞作用内在化，穿孔素的作用是介导粒酶B从胞吞小泡中释放。事实上，穿孔素可被其它破坏泡的因子取代，如腺病毒产生的因子(Froelich等，1996；Pinkoski等，1998；Browne等，1999)。粒酶一般高度同源，与GrB有38-67％的同源性(Haddad等，1991)，它们包含胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的催化三联体(His-57、Asp-102和Ser-195)。其它特征包括成熟的N末端Ile-Ile-Gly-Gly序列、三或四个二硫桥和保守基序(PHSRPYMA)，此基序也出现在嗜中性白细胞组织蛋白酶G和肥大细胞糜酶(chymases)中。粒酶的碳水化合物部分是Asn-相连(Griffiths和Isaaz，1993)。粒酶mRNA转录物翻译成前蛋白酶原。前或前导序列在内质网被信号肽酶裂解。当前肽被去除时，失活的前粒酶(酶原)成为活性蛋白酶。粒酶前肽序列开始于前导肽后并结束于N末端Ile前，需要蛋白酶以折叠成催化构象(Kam等，2000)。在迄今鉴定的多种细胞凋亡因子中，Bcl-2家族成员代表此死亡途径的一些意义明确的调节物。Bcl-2家族的一些成员促进细胞存活，包括Bcl-2、Bcl-XL、Ced-9、Bcl-w等，其它成员显示加强细胞凋亡，包括Bax、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bak、Bik和Bim(Adams和Cory，1998)。到目前为止关于Bcl-2家族成员可能的生物功能提出了一些不同的假设。这些包括二聚物形成(Oltvai等，1993)、蛋白酶活化(Chinnaiyan等，1996)、线粒体膜去极化(6)、产生反应性氧中间物(Hockenbery等，1993)、调节钙流出(Lam等，1994；Huiling等，1997)和孔形成(Antonsson等，1997；Marzo等，1998)。Bcl-2家族的一个21kDa死亡-促进成员Bax是第一个鉴定为与来自不同细胞系的Bcl-2共免疫沉淀的蛋白质(Oltvai等，1993)。过度表达Bax加速响应多种细胞毒性结果的细胞死亡。确定Bax蛋白的氨基酸序列显示它与Bcl-2高度同源。Bax基因由6个外显子组成且产生另外的转录物，它的主导形式编码1.0kb mRNA并命名为Baxα。像Bcl-2和一些其它Bcl-2家族成员，Bax蛋白有高度保守的区域BH1、BH2和BH3结构域，这些蛋白质序列的亲水分析表明在它们的C末端存在疏水的跨膜区段(Oltvai等，1993)。Bax广泛表达，没有任何明显的组织特异性。然而，在诱导细胞凋亡中，Bax转位到线粒体中，导致线粒体功能紊乱和释放细胞色素c，细胞色素c随后活化胱冬酶途径(Hsu和Youle，1997；Wolter等，1997；Gross等，1998)。此转位过程迅速且发生在细胞凋亡的早期阶段(Wolter等，1997)。Bax在人卵巢癌中通过腺病毒基因转移来选择性过度表达，导致在体内显著杀伤肿瘤细胞(Tai等，1999)。通过二元(binary)腺病毒系统在来自人肺癌的培养细胞系中过度表达Bax基因导致胱冬酶活化、细胞凋亡诱导和细胞生长抑制。此外，肿瘤内注射表达Bax基因的腺病毒载体抑制裸小鼠中建立的人肺癌异种移植物生长(Kagawa等，2000；Kagawa等，2000)。WO 99/45128和Aqeilan等(1999)针对有细胞靶向特异性和细胞凋亡-诱导活性的嵌合蛋白质，具体是重组嵌合蛋白质IL-2-Bax，特异靶向IL-2受体表达的细胞并诱导细胞特异的细胞凋亡。WO 99/49059涉及一种嵌合毒素，此毒素包括促性腺激素释放激素(GnRH)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合多肽，其特征在于，所述嵌合多肽含有细胞特异的靶向部分和信号转导途径因子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MG罗森布勒姆，Y刘，
申请(专利权)人：研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]