蛋白质修饰制造技术

Ｃ１抑制剂，其特征在于其血浆循环半衰期已通过Ｏ－连接碳水化合物的修饰而改变。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及糖基化化合物的修饰，更具体地涉及重组产生的糖基化化合物的修饰以增加其在血液中的循环寿命。
技术介绍
糖蛋白是缀合形式的含有一或多个共价结合的碳水化合物的蛋白质。根据聚糖和蛋白质之间连键的性质，蛋白质连接的碳水化合物可以分成两组，即附着于天冬酰胺残基的游离氨基上的N-连接碳水化合物，和连接于苏氨酸和丝氨酸残基的羟基的O-连接碳水化合物。本领域熟知糖蛋白的半衰期，即50％化合物被清除出血液循环所需时间，高度依赖于其N-连接碳水化合物的组成和结构。例如，从糖蛋白的碳水化合物中除去唾液酸将导致这些糖蛋白快速从循环中清除(Morell et al.(1971)J.Biol.Chem.246.1461)，因为去唾液酸化的糖蛋白被机体中的各种碳水化合物受体识别。参与清除的这类碳水化合物受体的例子包括肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体和甘露糖受体。在重组产生的人蛋白质中观察到相同的现象，这些蛋白质例如在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或转基因动物中产生的人蛋白质，它们通常含有比其未转基因的对应物少的唾液酸基团。迄今为止，广泛认可的是N-连接碳水化合物决定了糖蛋白的药动学性质。因此，优选的改善糖蛋白半衰期的策略是通过唾液酸化或除去末端半乳糖残基而修饰其N-连接碳水化合物。详细描述本专利技术涉及通过修饰O-连接碳水化合物而改变糖基化化合物的半衰期的方法。当本文中指称糖基化化合物时，优选是指糖基化蛋白或包含糖基化蛋白的化合物。本文中，半衰期定义为50％化合物被清除出血液循环所需时间。本文中，“碳水化合物”是指单糖和寡糖。迄今为止，据信半衰期高度依赖于并主要由N-连接碳水化合物的组成和结构决定。本专利技术人证实O-连接碳水化合物也可决定糖基化化合物的半衰期。这对于肠胃外给药的糖基化化合物的治疗应用直接相关，因为根据本专利技术方法半衰期可显著延长。本专利技术方法可以用于缩短或增加糖基化化合物的半衰期，在本文中称为“改变半衰期”。在本专利技术的一个实施方案中，在O-连接碳水化合物的修饰用于延长糖基化化合物的半衰期。通过这一修饰，修饰的糖基化化合物的半衰期与未修饰的化合物相比增加了至少10％、优选地至少30％、50％或70％。最优选的是修饰的糖基化化合物的半衰期值增加到未修饰化合物半衰期值的至少2倍、3倍或4倍。O-连接碳水化合物的修饰优选地用酶制剂经酶学反应进行。酶制剂可包含一种酶或者是酶的混合物。这些酶可有不同程度的纯度。它们可以是纯化的或者基本上纯的，但这不是必需的。体内和体外修饰方案均可用于修饰O-连接碳水化合物。体内修饰的例子包括但不限于例如通过一种或多种合适的酶的共表达而发生在细胞培养系统、转基因动物或转基因细菌或植物中的修饰。O-连接碳水化合物的修饰集中于加帽(capping)或除去末端半乳糖残基，由此干扰与清除所涉及的受体的结合，从而导致延长的血液中的循环半衰期。合适的酶包括但不限于用于末端半乳糖加帽的唾液酸转移酶，如ST3GalIII或ST3GalI或现有技术中已知的其它唾液酸转移酶。用于除去末端半乳糖的酶的例子为半乳糖苷酶和内乙酰半乳糖胺酶(endo-acetylgalactosaminidase)(O-糖苷酶)。半乳糖苷酶能够从N-或O-连接碳水化合物除去末端半乳糖，而内乙酰半乳糖胺酶水解非唾液酸化Galβ1，3GalNAc结构的多肽和半乳糖胺(O-连接于丝氨酸或苏氨酸)之间的共价键。在两种情况下，暴露的半乳糖残基均降低，并因此增加糖蛋白的循环寿命。修饰O-连接碳水化合物基团的一个优选方式为唾液酸化(sialylation)。一般地，唾液酸化涉及通过唾液酸转移酶的作用将唾液酸从一个唾液酸供体转移至糖基化化合物的碳水化合物基团。这可以在体内发生(例如通过在糖蛋白表达系统中共表达唾液酸转移酶)或在体外发生。目前，胞嘧啶核苷-5’-一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-唾液酸)被通常用作唾液酸供体。唾液酸转移酶可以重组产生或者分离自一种唾液酸转移酶源。生产重组唾液酸转移酶的方法已经在例如US 5,541,083中公开。用于本专利技术方法中的唾液酸转移酶的一个优选例子是ST3Gal I(EC 2.4.99.4)，优选为人ST3Gal I，但是来自非人哺乳动物或细菌来源的唾液酸转移酶也可以使用，优选与ST3Gal III(EC 2.4.99.6)联合应用。ST3Gal I特异性转移唾液酸至Galβ1，3GalNAc表位的末端半乳糖上，其是粘蛋白型O-连接碳水化合物的核心结构，而ST3Gal III特异于在复合和杂合型N-连接碳水化合物中经常存在的乳糖胺单位(Galβ1，4GlcNAc)。本文描述的方法可以用于改善任何糖基化化合物、特别是携带粘蛋白型O-连接碳水化合物的那些糖基化化合物的药动学性质。唾液酸化可以用已知方法例如WO98/31826中描述的方法进行。或者，糖基化化合物的循环半衰期可以经除去部分或全部O-连接碳水化合物链而修饰其O-连接碳水化合物基团来延长。优选地，部分或完全除去一或多个非唾液酸化O-连接碳水化合物链。例如，可以从一或多个碳水化合物链中除去一或多个非唾液酸化O-连接半乳糖。如上所述，除去一或多个O-连接碳水化合物或碳水化合物链可以在体内或体外进行。在体内除去的一个实施方案中，编码一或多个合适酶如半乳糖苷酶和/或内乙酰半乳糖胺酶的核苷酸序列在相同细胞中与糖蛋白共表达。编码合适酶的核苷酸序列可以来自任何来源，如人、小鼠、大鼠、细菌等，或者可以化学合成。在体外除去的一个实施方案中，一种或多种合适酶被体外加至重组糖蛋白中。半衰期欲改变的任何糖基化化合物均可以用于本专利技术方法中。以这种方式可以获得与未修饰的化合物的半衰期相比有缩短或延长的血浆半衰期的化合物。优选地，半衰期被缩短或延长至少10％、至少30％、至少50％或至少70％。最优选地，半衰期值至少降低至未修饰的化合物的半衰期值的2/3、1/2、1/3或1/4，或至少增加至未修饰的化合物半衰期值的1.5倍、2倍、3倍或4倍。所述化合物例如可在O-连接碳水化合物的唾液酸化之后或者在除去一或多个非唾液酸化O-连接碳水化合物之后获得。典型地，非唾液酸化O-连接碳水化合物是半乳糖或Gal(β1-3)GalNAc。这些修饰优选地经例如使用包含一或多种酶的酶制剂经酶学反应进行。合适的酶制剂包括一或多种唾液酸转移酶，一种或多种半乳糖苷酶和一种或多种内乙酰半乳糖胺酶。这三种类型的酶可以替换使用。在一个实施方案中，包含内-α-N-乙酰半乳糖胺酶的酶制剂用于获得修饰的化合物。本领域技术人员理解两或三种类型酶也可联合应用。本专利技术的化合物可用于制备药物组合物以用于治疗使用未修饰的对应化合物的应用中的个体。药物组合物典型地也包括药物学可接受的载体和任选地药物学可接受的佐剂。优选地，所述方法用于重组产生的糖蛋白。所述方法特别适用于改进打算经肠胃外给药的重组产生的糖蛋白的半衰期。文中“重组产生的糖蛋白”或“重组糖蛋白”是指通过复制异源核酸或表达由异源核酸编码的肽或蛋白质的细胞产生的糖蛋白。异源核酸典型地含有一个或多个在天然形式细胞中未发现的或者可能在此类细胞中发现但已被修饰或操作的基因。异源核酸可整合进转化细胞的基因组中。应理解的是重组糖蛋白无需包含全长糖蛋白，而是可包含其功能片段。天然存在的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：帕特里克·范贝克尔，莫里斯·曼内瑟，弗兰克·皮珀，
申请(专利权)人：法明知识产权股份有限公司，
类型：发明
国别省市：