一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法技术

本发明专利技术公开了一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法：(1)通过提取美洲大蠊RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，获得美洲大蠊过敏原蛋白编码基因片段；(2)将过敏原基因克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒pET28a(+)‑BA2，再转入宿主菌大肠杆菌BL21，用IPTG诱导其表达，采用亲和层析方法纯化，从而获得重组美洲大蠊过敏原蛋白BA2。通过药理实验显示：BA2蛋白能明显增加小鼠血清中的IgE含量(P<0.05)，能显著增加小鼠肺泡灌洗液和小鼠脾细胞上清液中IL‑4、IL‑5和IL‑13炎症因子的含量以及致使小鼠肺组织发生明显病理变化。本发明专利技术所述方法能够获得纯度较高的过敏原蛋白，为美洲大蠊过敏原后续研究以及其他动物体内潜在过敏原物质的研究提供参考依据。

An allergenic protein BA2 of Periplaneta americana and its expression method

The invention discloses a Periplaneta americana allergen protein BA2 and its expression method: (1) through the extraction of Periplaneta americana RNA, reverse transcription cDNA, using cDNA as the template for PCR amplification, obtained the Periplaneta americana allergen protein encoding gene fragment; (2) allergen gene was cloned into prokaryotic expression vector in the construction of recombinant expression plasmid pET28a (+) BA2, then transferred into E.coli BL21 and induced the expression of IPTG by affinity chromatography purification, to obtain recombinant Periplaneta americana allergen protein BA2. Pharmacological experiments showed that BA2 protein could significantly increase the content of IgE in serum (P< 0.05), the content can be significantly increased in mice and mouse spleen cells in bronchoalveolar lavage fluid in the supernatant of IL 4, IL 5 and IL 13 inflammation and cause obvious pathological changes of lung tissue in mice. The method can obtain high purity allergens, and provide reference for subsequent studies of Periplaneta americana allergy and other potential allergens in animals.

【技术实现步骤摘要】
一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法。
技术介绍
变态反应疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。变态反应疾病的发生极为广泛，全世界有1/3的人口患有变态反应疾病。在变态反应疾病中，支气管哮喘(简称哮喘)约占全部病例的1/4。哮喘可以由多种因素引发，其中过敏原，尤其是室内过敏原，具有十分重要的作用。室内过敏原主要包括动物皮屑、尘螨和蟑螂等。蟑螂可以引起哮喘的报道最早出现在上世纪60年代。美洲大蠊是蟑螂过敏诱发哮喘的重要过敏源。蟑螂，即美洲大蠊(Periplanetaamericana)，是我国南方室内蟑螂的优势种群。国内外学者通过皮试和支气管激发试验测定，发现约40％的哮喘患者对蟑螂过敏原过敏，证实蟑螂是仅次于屋尘和尘螨的主要室内过敏原携带者，且蟑螂过敏原是一种强吸入性过敏原。蟑螂诱发哮喘的病原学研究是近年来过敏与哮喘研究领域的热点。筛选新过敏原并对其过敏原性的研究对过敏性疾病的诊断和脱敏治疗都具有重要意义。在诊断和治疗蟑螂过敏性疾病时，广泛使用的是过敏原的粗浸液，但由于其成分复杂，很难进行标准化且在治疗中易导致免疫球蛋白(IgE)介导的其它过敏反应，因此限制了过敏原浸液在临床上的使用。随着基因工程技术的发展，重组蛋白逐渐被重视。与天然过敏原浸提液相比，重组过敏原的产量高，生产条件稳定，方便进行过敏原的标准化，利于临床诊断和治疗。近年来的研究证实重组蟑螂过敏原蛋白具有纯度高、易于标准化的特点，能安全和有效地为患者提供免疫治疗。与此同时，根据重组过敏原设计的疫苗被大量的运用到治疗过敏性疾病中。开发能有效治疗不同类型过敏症的免疫治疗疫苗已经成为新的研究热点。本专利技术拟通过PCR获得过敏原基因，构建pET-28a(+)-BA2原核表达载体，并对其原核表达产物进行纯化，获得BA2蛋白质，同时对BA2蛋白诱发小鼠哮喘进行研究，为美洲大蠊的过敏原的研究以及其他动物体内潜在过敏原物质的研究提供参考依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2及其表达方法，将PCR扩增得到的过敏原基因克隆入原核表达载体，构建重组表达质粒，再转入宿主菌并诱导其表达，从而获得过敏原蛋白BA2，本专利技术所获得的过敏原蛋白作用于小鼠可诱发其过敏性哮喘。本专利技术所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。进一步，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列由质粒所表达的氨基酸序列和过敏原基因所表达的氨基酸序列组成，其中过敏原基因所表达的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术所述的一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法为：a.从美洲大蠊组织中提取总RNA，反转录成cDNA；b.以cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得美洲大蠊过敏原的编码基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；c.设计并合成酶切位点引物:BA2-F5’-CGGCTAGCATGACGATTGACTTCTACTACTT-3’BA2-R5’-CCGCTCGAGTCATTTTTTTGTTTTGGACTCG-3’d.将步骤b所获得的编码基因克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒；e.将步骤d获得的重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白。进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用的表达载体为pET-28a(+)。进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用的双酶切位点为NheI和XhoI酶切位点。进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用的的宿主菌为大肠杆菌BL21。进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中采用IPTG诱导其表达，其中IPTG的终浓度为0.2mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间5～6h。进一步，所述的美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法中选用亲和层析方法纯化重组蛋白BA2，其中缓冲液含磷酸钠和咪唑。本专利技术所述的蛋白BA2为一种可诱发哮喘的过敏原蛋白。与现有技术相比，本专利技术通过提取美洲大蠊RNA，扩增出过敏原蛋白基因，经双酶切后连接到原核表达载体上，再转入宿主菌并诱导其表达，经His标签的亲和柱分离、纯化，从而获得美洲大蠊过敏原蛋白BA2；通过实验结果显示BA2蛋白为一种可诱发哮喘的过敏原蛋白，BA2蛋白刺激小鼠可致小鼠血清中IgE含量增高，肺泡灌洗液及脾细胞上清液中的炎症因子含量增高，肺组织发生明显病理变化。附图说明图1pET-28a(+)-BA2质粒双酶切鉴定电泳图，其中A为pET-28a(+)-BA2质粒经NheI/XhoI酶切，B为pET-28a(+)-BA2质粒酶切图2BA2蛋白小剂量表达SDS-PAGE分析，其中A是未添加IPTG菌液，B是加入0.2mmol/L的IPTG菌液图3纯化后蛋白胶图，其中A为SDS-PAGE胶结果，B为Western结果图4BCA法标准曲线图5不同处理组小鼠血清抗原特异性IgE水平图6不同样品对肺泡灌洗液中细胞因子IL-4的影响图7不同样品对肺泡灌洗液中细胞因子IL-5的影响图8不同样品对肺泡灌洗液中细胞因子IL-13的影响图9不同样品对脾细胞培养上清中的细胞因子IL-4影响图10不同样品对脾细胞培养上清中的细胞因子IL-5影响图11不同样品对脾细胞培养上清中的细胞因子IL-13影响图12不同样品对肺组织的影响具体实施方式以下结合实施例的具体实施方式对本专利技术的内容作进一步的详细说明。实施例11实验材料1.1实验样本美洲大蠊由四川好医生药业集团有限公司提供。30只SPF级BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～22g，由四川大学实验动物中心提供。随机分为3组：PBS对照组5只、美洲大蠊粗提液处理组10只和BA2蛋白处理组10只，各组分笼饲养。1.2实验菌株及质粒所用菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，所用载体为pET28-a(+)质粒，购于Novagen公司。1.3实验仪器离心机、摇床、电热恒温水槽、PCR仪、电泳槽、凝胶成像系统、半干转印系统转印槽(Bio-Rad)、迷你垂直电泳仪、蛋白层析系统、超声波破碎仪、酶标仪、连结仪(Eppendof)；1.4实验试剂及耗材限制性内切酶NheI和XhoI(Takara公司)、Taq酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)、T4DNA连接酶(Takara公司)、割胶纯化试剂盒(OMEGA公司)、DL2000DNAMarker(成都擎科梓熙生物技术有限公司)；氢氧化铝凝胶、RPMI-1640、胎牛血清、青、链霉素双抗(上海生工生物工程技术服务有限公司)、离心管、红细胞裂解液、细胞筛、0.22μm过滤器(北京全式金生物科技有限公司)、His亲和层析柱(GE生物公司)；1.5主要试剂的配制(1)磷酸盐缓冲溶液(PBS)：NaCl：8g；Na2HPO4：1.44g；KCl：0.2g；KH2PO4：0.24g用HCl调节溶液的pH值至7.4加ddH2O定容至1000ml，在120psi高压下蒸气灭菌20min。保存于室温；(2)考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250或R250(Fisher)：0.5％；甲醇：40％；乙酸：10％将考马斯亮蓝G250或R250溶于甲醇中搅拌15min。各溶液加好后ddH2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其特征在于，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其特征在于，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2，其特征在于，所述过敏原蛋白BA2的氨基酸序列由质粒所表达的氨基酸序列和过敏原基因所表达的氨基酸序列组成，其中过敏原基因所表达的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。3.一种美洲大蠊过敏原蛋白BA2的表达方法，其特征在于，所述表达方法包括以下步骤：a.从美洲大蠊组织中提取总RNA，反转录成cDNA；b.以cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得美洲大蠊过敏原的编码基因片段SEQIDNo.3；c.设计并合成酶切位点引物：BA2-F5’-CGGCTAGCATGACGATTGACTTCTACTACTT-3’BA2-R5’-CCGCTCGAGTCATTTTTTTGTTTTGGACTCG-3’d.将步骤b所获得的编码基因克隆入原核表达载体中，构建重组表达质粒；e.将步骤d获得的重组质粒转入宿主菌，诱导其表达并纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿福能，岳碧松，沈咏梅，
申请(专利权)人：四川好医生攀西药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川,51