肠毒素C2全基因及其克隆和异源表达方法技术

本发明专利技术涉及基因重组和蛋白表达技术，具体地说是肠毒素Ｃ２全基因及其克隆和异源表达方法，肠毒素Ｃ２具有序列表ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１中碱基序列。本发明专利技术以ＳＥＣ１和ＳＥＣ３基因序列为基础，设计ＰＣＲ引物，利用ＰＣＲ技术，克隆ＳＥＣ２全基因，并在大肠杆菌中表达，表达的ＳＥＣ２经检验具有野生型的生物学活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肠毒素C2基因克隆和蛋白表达，具体说是金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)全基因及其制备和异源表达。
技术介绍
金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类细菌超抗原，它们无需抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)的加工，也不受组织相容性复合体(MHC)的限制，在APC之外与T细胞受体Vβ链形成MHCII-SE-TCRVβ复合物，在1-10ng/ml浓度时，即能刺激大部分有TCRVβ序列的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生极强的免疫应答效应。研究发现，SEs可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用(Sag-dependent cell-mediated T-cell-derived cytotoxicity，SDCC)，从而产生系统的抗肿瘤反应。目前对肠毒素的克隆表达研究多集中于SEA和SEB，而对于有三个亚型的SEC族研究较少。三者的成熟蛋白氨基酸序列高度同源，SEC1和SEC3的基因序列已有报导，而SEC2的基因序列尚不清楚，SEC2的抗肿瘤作用已经应用于临床，并取得很好疗效。克隆并测定SEC2的全基因序列对研究C型肠毒素三亚型之间的关系和提高SEC2的肿瘤临床治疗效果具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种编码金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)成熟蛋白的全基因及其制备和异源表达，利用本专利技术可使SEC2产量较原始生产菌株大大提高(约提高106倍)。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下肠毒素C2全基因，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。肠毒素C2全基因的克隆方法以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-F5’-GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’sec2-R5’-CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’通过PCR技术扩增出SEC2基因片段。肠毒素C2全基因的异源表达方法将肠毒素C2全基因亚克隆至表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建成异源表达SEC2蛋白的基因工程菌，在LB培养基中异源表达具有生物学活性的SEC2蛋白。本专利技术具有如下优点1.本专利技术为人工构建的SEC2基因，首次获知基因全序列的组成。2.本专利技术以SEC1和SEC3基因序列为基础，设计PCR引物，利用PCR技术，克隆SEC2全基因，并在大肠杆菌中表达，表达的SEC2经检验具有野生型的生物学活性；应用本专利技术，可提供直接用于生产SEC2蛋白的基因工程菌株。3.本专利技术基因的异源表达提供了制备超抗原抗肿瘤生物制剂的一种新方法，具有产量高，生产稳定，方便纯化的特点。附图说明图1为SEC2基因sec2的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中1为sec2的PCR扩增产物，2为DL2000DNA分子量标准；图2为pET-28a-sec2的双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中1为DL15,000DNA分子量标准，2、3为pET-28a-sec2的双酶切结果，4为DL2000DNA分子量标准；图3为SEC2的大肠杆菌异源表达SDS-PAGE电泳图，其中1为诱导的pET28a空载体，2为蛋白分子量标准(由上至下分别为116，66，45，35，25，18，14KD)，3为诱导的SEC2的可溶性表达，4为诱导的SEC2的包涵体表达；图4为表达的SEC2蛋白的蛋白免疫印记检测图，其中1为SEC2蛋白的蛋白免疫印记检测结果，2为预染的蛋白分子量标准。具体实施例方式实施例1SEC2全基因的制备，具有SEQ ID NO1所示的序列001 G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C A C A A A T C A A G T G A G T T051 T A C T G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T101 C A G C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T151 T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A201 G T T A T T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G251 T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A T A A T301 G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A A C A A A351 A C A T G A A G G A A A C C A C T T T G A T A A T G G G A A C T T A C A A A A T G T A C T T A T A A401 G A G T T T A T G A A A A T A A A A G A A A C A C A A T T T C T T T T G A A G T G C A A A C T G A T451 A A G A A A A G T G T A A C A G C T C A A G A A C T A G A C A T A A A A G C T A G G A A T T T T T T501 A A T T A A T A A A A A A A A T T T G T A T G A G T T T A A C A G T T C A C C A T A T G A A A C A G551 G A T A T A T A A A A T T T A T T G A A A A T A A C G G C A A T A C T T T T T G G T A T G A T A T G601 A T G C C T G C A C C A G G C G A T A A G T T T G A C C A A T C T A A A T A T T T A A T G A T G T A651 C A A C G A C A A T A A A A C G G T T G A T T C T A A A A G T G T G A A G A T A G A A G T C C A C C701 T T A C A A C A A A G A A T G G A T A A(1)SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】
肠毒素Ｃ２全基因，其特征在于：具有序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：１中碱基序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈巨余，徐明恺，张成刚，
申请(专利权)人：沈阳协合集团有限公司，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]