生产木质素降解酶的木腐担子菌制造技术

本发明专利技术涉及利用高效发酵技术，从某些白腐担子菌纲真菌生产木质素降解酶、漆酶和锰过氧化物酶。本发明专利技术的目的是构建一个新的经济省时的生产上述酶的整体方法，包括使用特定的蘑菇菌株、发酵方法和分离－纯化技术。尤其是开发了特定菌株在来自有机废料的各种木质素纤维素底物上的深层发酵，所述有机废料是例如小麦谷粒生产乙醇的废料、桔皮和糠。可以选择培养条件来改变漆酶／锰过氧化物酶的比例，以有利于漆酶或者锰过氧化物酶的生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从白腐真菌产生木质素降解酶例如漆酶、锰过氧化物酶和木质 素过氧化物酶。
技术介绍
白腐真菌(white-rot fimgi)的特点在于,难,的木质多聚t/~~木质 素的独特能力。与白腐真菌木质素降解能力相关的主要酶是木质素过氧化物酶 (LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac),尽管上述真菌并不具有相同 的一组酶。最近，己对这些真菌进行了广泛研究，目的在于分离新的微生物， 所述微生物可增加分泌木质素降解酶和具有对工业应用重要的特性的酶，其中 所述工业应用为危险外源化学物(xenobiotics)污染的工业废水流生物治理； 生物漂白禾姓物制浆；纺织和印染工业；药物和其他中间体的生物转化；食品 工业；生物传感器构建；化妆品；医学和分析生化。所有这些生物技术应用都 需要大量劇介的酶。但是，由于生产和分离过程中的低产量和高成本，当前所 制备酶价格仍然高昂。此外，尽管许多重组生物能够有效地过量生产各种工业 酶，然而，在异源系统中还没有实现漆,卩过氧化物酶的稳定表达，它们仍需 从天然来源获得。因此，主要任务是扩展生产木质素,酶的生物的范围，通 过优化培养剝牛尤其是通3t添加特异的酶诱导物，以增加其产量。在过去几年中，经常尝试使用白腐真菌生产木质素降解酶。黄孢原毛平革 菌(尸/z朋erac/7aete c/ />i wpohww)、栓菌属(7"rametes)禾卩侦U耳属(尸/ewra uy) 物种、以及射脉侧菌(尸似e^ra血to)是研究最广泛的担子菌。现己知白腐真 菌木质素降解机制是受养料高度调节。尤其是，碳和氮源以及几种芳香化合物 和微量元素，显示出强烈的调节作用。根据收集的数据，己经有数种方法被用 于鹏酶生产在氮或碳限制剝牛下培养真菌，在营养培养基中添加诱导物例 如二甲代苯胺、阿魏酸和藜芦基醇，以及添加乙醇、锰盐、聚丙二醇、磷脂和 不饱和脂肪酸。例如，JAGER等人(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1985，第1274-1278页)建议在深层培养物submerged cultrues中添加去污齐lj，例如TWEEN 80或TWEEN 20，与当前静置培养中所获得的 相比，可增加木质素过氧化物酶按比例计的产量。LEISOLA等人(J. BIOTECHNOL.， 1985，第97-107页)已报道添加藜卢基醇增加木质素过氧化 物酶合成。ASTHER等人提出(美国专利5,153,121)从黄孢原毛平革菌 (尸/ 朋erac/^"e c/ o^^/ on'ww)生产木质素过氧化物酶的方法，包括在不同培 养步骤添加磷脂、乳化脂肪酸和藜芦基醇并改变成分含量。在导入250 ml锥形 烧瓶的100 ml培养基中，获得的木质素过氧化物酶产量为46.4 nkat/ml。固定 在聚氨基甲酸酯泡沫上的细胞，产酶量为25nkat/ml/天。IRVINE等人(美国专利5,342,765)提出一种方法，通过在氧渗透表面上 固定黄孢原毛平革菌(尸/ 朋erac/ a她c/ o^y/7ohww)，并通过氧渗透表面给微 生物供氧，真菌胞外酶生产可达230单位/L (U/L)的水平，而且在八批次的 生产周期平均产量达121U/L。将藜芦基醇(1 mM)与生产培养基一起使用， 可，木质素过氧化物酶生产。另一种方案(美国专利5,972,672)是在生物反应器内固定的黄孢原毛平革 菌(/^朋erac/zaefe c/70^^o"'ww)上进行，所述黄孢原毛平革菌通过非常复杂 的、包括磷脂和藜芦基醇的培养基提供养料。以20L/h流速，供应纯氧 泡气流。在这些割牛下，最大的MnP和LiP活性分别是10000U/L和2400U/L。Call (美国专利5，403，723)利用单色下皮黑菌(Cerre"a ww'co/or)作为漆 酶生产菌。已经开发出非常复杂和昂贵的培养基用于真菌培养。除主要培养基 成分以外，培养基还包含酵母细胞，或者苯甲醛、氯苯甲醛、硝基苯甲醛、羟 基苯甲醛、氨基苯甲醛、甲基苯甲醛、二芳基或三芳基、二烃基烷、三烃基烷、 或环亚胺、或，物质衍生物，作为诱导化合物。每天，烧瓶通02 30秒 (1001/小时)。培养周期是4-5天。酶产量大约是1500-2000IU/1。然而，对使大规模工业生产有利润来说，这些及其他方案中的木质素, 酶产量或者生产水平仍是不能令人满意的。它们使用非常昂贵的设备和培养基 成分；一些使用的诱导物是有毒的。因此，为了开发商业上可行和低财的木 质素降解酶生产技术，需要能够过表达酶活性的真菌，以及利用简单无毒培养 基和快速廉价制备工艺以确保最高酶活的工艺。本专利技术的方法涉及在特别配制 以生产高产量目标酶的营养培养基上利用浸没培养从白腐真菌生产木质素糊军 酶，所述生产利用木质素纤维素工农业废料发酵。专利技术概述本专利技术人目标是增加白腐担子菌生产胞外漆酶和锰过氧化物酶的产量，并陶氏成本。为此目的，我们成功检测了新品系(单色下皮黑菌(Cerrena unicolor) 和变色栓菌(Trametes versicolor)，它们能够高分泌漆酶和锰过氧化物酶。 我们发现了一种从担子菌纲真菌生产胞外酶的优良培养基，所述培养基尤其是 用于从上述白腐真菌生产漆酶和锰过氧化物酶。为此，开发出了利用木质素纤 维素底物的深层(submerged)发酵技术，所述底物是例如小麦谷粒生产乙醇 的废料、桔皮、糠和其他物质。尤其是，我们设计了特别的培养条件，它可以 在发酵罐中进行，使酶产量显著增加。我们发现，优选首先建立合适培养斜牛 (搅拌，通气，培养基pH)以使真菌在开始的2-3天保持最适生长，而在发酵 第二阶段设置的培养条件，则以目标酶的优势合成为目的。，方法相对于现 有技术培养，可使漆酶和锰过氧化物酶产量显著增加。此外，本专利技术的实施使 得可以根据需要，调节和改变漆,锰过氧化物酶的比例。专利技术详述本专利技术的总体目标是两方面的。本专利技术的第一个方面是白腐真菌，尤其是 变色栓菌(Cerrameto Unicolor)和单色下皮黑菌(Cerrewa wmcolor)，它们在 格鲁吉亚(前苏联共和国)分离，保藏在荷兰培养物保藏中心(Ce加aalbureauvoor Schimmelcultures，国际保藏单位，临时索引变色栓菌CBS 117346和单色下 皮黑菌CBS 117347)。本专利技术的第二个方面是从上述白腐真菌的培养物中生产漆酶和/或锰过氧化 物酶的方法，所述方法的特点在于包括培养至少一个选自上述菌株的菌株。上述培养物生产的基础依赖于担子菌培养物生长实践的标准技术，该技术 本身得知于从预培养物所，浆菌丝片段的接种物。所述方法适合于任意需氧 微生物，包括细菌、真菌和酵母，它们具有木质素纤维素降解酶系统，因此它 们具有,木质素纤维素作为养分的能力。可用于本专利技术方法的真菌实例包括白腐真菌，例如变色栓菌(Trametes versicolor)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉侧菌(Phlebia radiata)、石更毛拴孔菌(Funalia trogii)、单色下皮黑菌(Cerrena Unicolor)， 它们产生漆酶和/或锰本文档来自技高网...

【技术保护点】
特定木腐担子菌菌株，所述菌株在包含特定木质素纤维素底物的深层培养物中生长，用于生产木质素降解酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：V埃利萨施维尔，M雷布恩，
申请(专利权)人：迈科酶有限公司，
类型：发明
国别省市：IL[以色列]