一种菌根真菌在金线莲大面积栽培中的应用技术，所用的４种菌根真菌为小菇属真菌：石斛小菇（Ｍｙｃｅｎａ ｄｅｎｄｒｏｂｉｉ），紫萁小菇（Ｍｙｃｅｎａ ｏｓｍｕｎｄｉｃｏｌａ），兰小菇（Ｍｙｃｅｎａ ｏｒｃｈｉｄｉｃｏｌａ），开唇兰小菇（Ｍｙｃｅｎａ ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌａ）；先分别培养菌根真菌和金线莲苗，当金线莲苗移栽到大田时，加入菌根真菌与金线莲苗共同栽培。采用该项新技术，可大大缩短金线莲的生长周期，提高金线莲产量和有效成分含量。该项技术栽培方法简单、易于大面积推广、投资少、不施任何化学肥料、激素和农药，生产出的金线莲为绿色产品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体地说涉及一项在金线莲大面积栽培中应用菌根真菌以缩短金线莲生产周期，提高金线莲产量和质量的技术方法。
技术介绍
金线莲是一种名贵珍稀的中草药，为兰科开唇兰属(金线莲属)(Anoectochilus Blume)多年生草本植物，在我国主要分布于浙江、福建、江西、广东、广西、海南、贵州、云南、西藏、台湾等省区。金线莲是全草入药，具有清热凉血、祛风利湿、强心、降血压、解毒、止痛、镇咳等功效，民间多用于消炎、镇痛，治疗肺结核、肺热咳嗽，风湿性关节炎、小儿惊风、跌打损伤、蛇伤等多种疾病，均有很好疗效。近年来，金线莲又被用于治疗高血压、糖尿病、肝炎及肿瘤等疑难病症，其功效日益引起医药界的重视。金线莲在民间素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，在台湾更是被称为“药王”。经测定发现，金线莲中氨基酸类成分的组成和含量，以及具有抗衰老活性的微量元素的含量均高于西洋参。 金线莲生于海拔400-1200米之间的阔叶林或针阔叶混交林中，一般生长在通风良好、湿度高、光线较弱的山涧常绿阔叶林下，石壁、沟边、岩缝等阴湿地带也常有分布。金线莲的分布范围较窄，生长的生态条件独特，自然繁殖率低，生长缓慢，加上鸟类嗜食，使金线莲自然资源储量极其有限。近年来对该植物的需求量猛增，产区人们过度采挖，导致金线莲野生资源日渐枯竭。由于金线莲资源紧缺、价格昂贵，对金线莲的研究多涉及文献考证、组培及商品调查等方面。从1990年开始，福建省科委、教委和林业厅陆续设立专项基金进行金线莲的组织培养及栽培技术研究，目的是为提高金线莲繁殖速度和进行金线莲的人工栽培奠定基础。在金线莲菌根研究方面，江海燕等观察到有真菌侵染金线莲种子的现象；我们在野生金线莲的根中也观察到有真菌的存在，并从该类植物中分离出多种内生真菌。 金线莲试管苗快速繁殖已经获得了成功，但试管苗出瓶后成活率低，生长缓慢，生产周期长，有效成分含量低。到目前为止，由于这些问题的存在，使得金线莲的生产还不能实现大面积的人工栽培。利用菌根技术将金线莲与菌根真菌共生培养，筛选出能有效促进金线莲生长发育的优良菌株，对保存金线莲种质资源，提高药效，开辟金线莲大面积栽培生产的新途径具有重大理论意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种应用菌根真菌大面积栽培金线莲的方法，该方法可以提高金线莲的繁殖率和栽培成活率，可以缩短栽培金线莲的生长周期，提高金线莲的产量和质量，解决金线莲资源短缺的问题。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术是先分别培养菌根真菌和金线莲苗，当金线莲苗移栽到大田时加入菌根真菌共生栽培。本专利技术采用的4种小菇属菌根真菌经培养鉴定，分别为分离自铁皮石斛的石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，分离自天麻的紫萁小菇MO-1(Mycenaosmundicola)，分离自墨兰的兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)和分离自福建金线莲(花叶开唇兰)的开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)。这4种真菌于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为MD-1CGMCC No.0685；MO-1CGMCC No.0689；MO-2CGMCC No.0688；MA-1CGMCC No.0687；保藏和存活证明见附件。 具体地说，本专利技术所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本专利技术中所述的比例均为重量百分比) 1.菌根真菌的培养 将上述4种菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于22-28℃恒温培养10-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中分别进行发酵培养制成种子菌种；种子菌种可以进一步接入液体或固体培养基进行放大培养。 真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量为2-5％。培养基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量10-60％。培养基灭菌后接入上述菌根真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-20％。菌根真菌液体培养的培养条件为振荡转速80-150转/分钟，18-28℃暗培养10-30天。培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。 菌根真菌固体培养的培养基中天然纤维性或淀粉性物质可以为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的1-4倍。培养基pH 5.0-6.5。试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％。培养基灭菌后接入液体培养的小菇属真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的5-15％。固体培养的培养条件为18-28℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时(2个月左右)取出备用。 2.金线莲苗的培养 金线莲带有节的茎段经过芽分化、丛芽增殖、壮苗生根等步骤的培养，培育成苗。经壮苗生根培养后的金线莲苗可以在继代培养基上继代培养。各步骤所用培养基及培养时间分别为 (1)用于芽分化的培养基是以MS培养基为基本培养基，附加6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA0.5-3.0mg，NAA0.4-2.5mg。培养时间45-120天。 (2)用于丛芽增殖的培养基是以MS培养基为基本培养基，附加6-BA、吲哚丁酸(IBA)和玉米素(ZT)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA0.5-3.0mg，IBA0.3-1.5mg，ZT0.05-0.3mg。培养时间45-120天。 (3)用于壮苗生根的培养基使以MS培养基为基本培养基，附加NAA和IBA，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.5-3mg，IBA0.5-2mg。培养时间为45-120天。 (4)用于苗继代的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入马铃薯(煮汁)100-300g。培养时间45-90天。 金线莲芽分化、金线莲丛芽增殖、壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(L)MS和1/2MS基本培养基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g。壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(L)培养基中均要添加活性炭0.5-4g。培养基pH 5.0-6.5。用试管或玻璃瓶等器皿培养，培养容器装量10-50％。苗的培养条件为15-26℃光照培养，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天。 3.金线莲苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理及收获 金线莲苗与菌根真菌的共生栽培基质有以下几种 (1)基质1中可以有蛭石和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为蛭本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用菌根真菌大面积栽培金线莲的方法，包括步骤：（１）菌根真菌的发酵培养将４种菌根真菌ＭＤ－１，ＭＯ－１，ＭＯ－２，ＭＡ－１自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于含ＰＤＡ培养基的平皿中，于２２－２８℃恒温培养１０－２０ 天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养；由平皿固体菌种转接液体培养的ＭＤ－１，ＭＯ－１，ＭＯ－２和ＭＡ－１真菌可以直接使用，也可以作为种子菌种，种子菌种再进一步接入液体或固体培养基进行放大培养； 真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振荡或发酵罐通气暗培养，培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；真菌固体培养的培养基含有天然纤维性或淀粉性物质，真菌用试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等 器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；（２）金线莲苗的培养金线莲带有节的茎段经过金线莲芽分化、金线莲丛芽增殖、壮苗生根培养等步骤的培养，用玻璃三角瓶或玻璃罐头瓶等器皿静置光照培养，培育成苗；经壮苗生根培养后 的金线莲苗可以在继代培养基上继代培养；金线莲芽增殖、金线莲丛芽增殖、壮苗生根等步骤所用的培养基是以ＭＳ培养基为基本培养基；苗的继代培养所用的培养基是以１／２ＭＳ培养基为基本培养基；以上培养基都需要在基本培养基的基础上添加蔗糖、肌醇、 琼脂，或添加活性炭，添加不同种类和浓度的植物激素，或添加马铃薯提取物；（３）金线莲苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理和收获金线莲苗与菌根真菌大面积共生栽培的栽培基质含有蛭石、泥炭土、腐殖土、砂子；金线莲苗和菌根真菌按以 下方法共生栽培：①地上遮阳栽培：在具有遮阳网的露天大棚，或塑料薄膜温室，或玻璃温室中进行栽培，栽培时先在金线莲苗根的基部放置适量碎树叶，再在金线莲苗根部放置以上备好的液体或固体菌根真菌适量，最后用栽培基质埋住金线莲苗的根部； ②立体遮阳栽培：在地上搭架分层立体栽培，在硬质材料的盆或盒等容器的底部平铺一层共生栽培基质，栽培时先在金线莲苗根的基部放置适量碎树叶，再在金线莲苗根部放置以上备好的液体或固体菌根真菌适量，最后用栽培基质埋住金线莲苗的根部；在金线莲生 长的过程中可以根据需要补施液体或固体菌根真菌；金线莲苗出瓶后与菌根真菌共生栽培６－１２个月后即可收获。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭顺星，于雪梅，高微微，陈晓梅，王春兰，孟志霞，肖培根，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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