本发明专利技术属于分子标记筛选领域。涉及一种控制甘蓝型油菜开花期的分子标记及应用。所述的分子标记克隆自BnaA10.CO基因，其位于甘蓝型油菜的A10染色体上，是开花期调节网络中光周期途径的关键基因。从冬性油菜和春性油菜中克隆BnaA10.CO基因片段，还片段的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。与开花期相关的分子标记引物如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。转化证实该基因来源于冬性油菜的等位基因，促进开花的作用强于春性油菜的等位基因。来源于冬性油菜的等位基因可以缩短半冬性油菜的生育期。根据BnA10.CO基因区的第25‑27位的InDel差异开发的分子标记可以用于油菜早熟育种。
【技术实现步骤摘要】
一种控制甘蓝型油菜开花期的分子标记及应用
本专利技术属于油菜基因工程领域，具体涉及一种控制甘蓝型油菜开花期的分子标记及应用一种分子标记的制备及应用。本专利技术的分子标记来源于BnaA10.CO基因，该基因位于甘蓝型油菜的A10染色体上，是开花期调节网络中光周期途径的关键基因。本专利技术公开了从冬性、半冬性和春性油菜中分离克隆得到BnaA10.CO，本专利技术还涉及了利用该基因片段的分子标记的开发以及在油菜早熟性状育种中的应用。
技术介绍
甘蓝型油菜(Brassicanapus)是世界上广泛种植的重要油料作物。菜籽油不仅可以作为食用油，也是润滑油及生物柴油等工业原材料。从1975年到2012年的将近40年里，甘蓝型油菜的世界总产量已经增长了8倍，2012年产总量达到64.8百万吨(http://faostat.fao.org/)。甘蓝型油菜如此迅速的增长速度主要取决于品质的遗传改良(低硫苷和低芥酸)以及杂种优势的利用。根据低温春化需求的差异可以划分为冬性、半冬性与春性三种类型。冬性油菜在生长发育过程中需要经历较长时间的低温春化(10℃以下)才能抽薹开花，生育期内光照长度变化较大，生长周期较长；春性油菜品种不需要低温春化就可以开花结实，生育期较短，生长周期内光周期变化不大。半冬性油菜则介于二者之间，温度和光周期对开花时间都有较大影响。我国90％油菜种植区域分布在长江流域各省，主要为半冬性类型的品种，这些区域一般采用两熟或三熟制种植模式(水稻或棉花、玉米、高梁、甘蔗、烟草等+油菜两熟制；或早稻+晚稻+油菜或水稻+旱作+油菜三熟制)。在这些种植模式下，茬口矛盾较为突出。同时，随着机械化和直播等“轻简化”栽培技术的广泛使用，省去了苗床生长期，需要生育期更短的油菜品种。因此利用分子标记辅助选择技术培育具有适宜开花期的高产优质油菜新品种是迫切需要解决的问题。传统育种工作依赖于育种家的经验和机遇,往往存在很大的盲目性和不可预测性,而分子育种能显著提高育种效率,为保障我国粮食安全提供强有力的技术支撑。利用分子标记对目标性状基因型进行选择的方法称为分子标记辅助选择(molecularassistedselection,MAS),包括对目标基因跟踪即前景选择和对遗传背景的选择，MAS应用于作物遗传改良已取得了长足进展,主要集中体现在以下几个方面：(1)优良基因聚合；(2)基因转移；(3)数量性状的MAS(刘志文等，2005)。光周期是影响植物开花重要的环境因素，CO(CONSTANS)是光周期途径中的关键基因。光受体接受光信号后就会引起下游相关基因CCA1、LHY、ELF3、TOC1等的表达(Doyleetal2002；Hazenetal2005)，这些基因的表达又会引起GI和CDF1的表达从而启动或抑制开花关键基因CO的表达(Imaizumietal.,2005)。CO蛋白促进下游FT的表达，FT表达的蛋白作为“成花素”从韧皮部运输到茎顶端分生组织促进花分生组织特异基因AP1、LFY等基因的表达，从而使植物开花(Corbesieretal.,2007)。目前，对芸薹属作物开花性状的研究还主要集中在QTL定位、QTL互作、GWAS分析和候选基因预测等方面(Osbornetal.,1997；Zhaoetal.,2005；Delourmeetal.,2006；Longetal.,2007；Caietal.,2008；Xiaoetal.,2013)。克隆油菜光周期途径基因并用于早熟性状的辅助选择还未见报道和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于油菜开花调控网络中的光周期途径关键基因BnaA10.CO分子标记及其在选育油菜早熟品系中的应用，本专利技术包括从冬油菜、半冬性油菜和春油菜中克隆得到BnaA10.CO基因，利用该基因的第一外显子的Indel位点开发了基于PCR的分子标记，该标记用于辅助选择长江流域半冬性油菜较早开花的油菜品系，从而使油菜提早开花5-7天。本专利技术提出了利用等位基因存在较小功能差异的光周期途径基因特异标记辅助选择使油菜开花期提前5-7天，但不改变油菜品系原来的春化需求条件，适合长江流域的生长条件；本专利技术能够在油菜选育过程中定向选择，即利用一个基因位点达到早熟育种要求，降低育种成本，以解决长江流域的作物种植茬口的矛盾。具体地，本专利技术通过如下技术方案实现：甘蓝型油菜早熟性状基因特异分子标记的应用，所述的应用步骤包括基因克隆、等位基因序列和功能鉴定、分子标记开发以及辅助选择改良半冬性油菜开花期，具体步骤如下：(1)利用PCR方法分离了冬油菜Tapidor(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)和春油菜Westar(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)BnaA10.CO基因完整的编码区序列(序列见SEQIDNO：1和SEQIDNO：3)，发现在外显子上有碱基突变和InDel变异，其中同义突变的有5个，非同义突变的有7个。随后申请人又克隆了12份冬油菜、8份春油菜和9份半冬性油菜(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)的BnaA10.CO基因全长CDS序列，发现这些突变位点组成两种单倍型：即单倍型1和单倍型2。其中，冬油菜中只包含单倍型1，春油菜中只包含单倍型2，而半冬性油菜则包含两种单倍型。(2)将冬性油菜Tapidor和春性油菜Westar全长BnaA10.CO基因与BnaA10.CO的1.8kb启动子构建成表达载体。将构建好的表达载体转化拟南芥Col-0，获得阳性转基因T3代株系。结果发现无论是长日照条件还是短日照条件，转冬油菜性BnaA10.CO基因的拟南芥植株开花都要早于转春性BnaA10.CO基因的植株，而且两种转基因植株的开花时间都要早于野生型拟南芥。莲座叶数目统计分析显示，也得到一致的结果。由此说明了冬性和春性BnaA10.CO等位基因都具有促进植物开花的作用，但是冬性油菜BnaA10.CO等位基因的促进作用强于春性油菜的BnaA10.CO等位基因。(3)根据BnaA10.CO基因编码区的第25-27位的1个InDel侧翼序列，设计一对基于PCR的InDel标记，该标记是由两条引物序列组成，其DNA序列如下所示：正向引物BnaA10.CO-InDel-F：5’-ATCAGTGAGCTAACATGTTCAAACA-3’，反向引物BnaA10.CO-InDel-R：5’-AGAGACACATCATCTGCCTCA-3’(如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示)。(4)以含有冬性油菜BnaA10.CO的等位基因的油菜品种Surpass(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)和油菜品种富油2号(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)为供体亲本，含有春性BnaA10.CO等位基因的半冬性油菜油菜品种中双11号(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)和油菜品种宁油7号(华中农业大学油菜研究室提供，原始来源见表1)为轮回亲本，经过连续回交两代，利用BnaA10.CO基因特异标记在回交的每代中对冬性等位基因进行检测，使含有冬性等位基因的后代与轮回亲本进行回交，最终可以使油菜品种中双11号和油菜品种宁油7号的开花期提前了4-6天。本专利技术分子标记和筛选方法可用于常规油菜或杂交油菜本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离克隆的冬性油菜中BnA10.CO基因在油菜早熟性状育种中的应用，其特征在于所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离克隆的冬性油菜中BnA10.CO基因在油菜早熟性状育种中的应用，其特征在于所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的应用，所述的应用包括调控油菜的开花期。3.一种与油菜开花期相关的分子标记引物，其特征在于，所述的分子...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，刘克德，李海涛，李娟娟，郭涛，殷帅，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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