甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法技术

本发明专利技术属于油菜育种技术领域，公开了一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法，序列为：SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：22。本发明专利技术筛选的分子标记是不育系Bnmfs的不育基因两侧紧密连锁的标记，缩小了不育基因在甘蓝型油菜染色体的区间，为后续该基因的克隆奠定基础；筛选的分子标记，特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简单；筛选了共显性标记，能鉴别分离群体中显性纯合、杂合和隐性纯合单株，可以克服传统育种依靠表型进行选择的特点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快育种进程。

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法
本专利技术属于油菜育种
，尤其涉及一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法。
技术介绍
在甘白种间杂交后代中，首次发现雌雄同时败育的性状，由一对隐性基因控制，该不育系定名为Bnmfs，并且进行基因定位。2009年，四川农业大学李平课题组发现了一份雌雄不育的水稻突变体MFS-Z9，并且定位到水稻第2号染色体上，其它作物中，如：小麦、大豆等作物中发现了雌雄不育的植株，但是主要集中在细胞学研究上。根据目前研究，甘蓝型油菜雌雄不育基因无连锁的标记，其它作物的标记也无法应用到该材料中。利用1536对AFLPs(EcoRI/MseI,PstI/MseI,ScaI/MseI)标记和917对SSR标记(来源于http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php,http://brassicadb.org/brad/geneticMarker.php)在2:2(不育：可育)混池(各取10株)的F2衍生群体(近等基因系)中筛选，得到7对AFLP标记和1对SSR标记有多态性。在614株单株中也能找到多态性。7对AFLP标记测序后Blast分析，其中4对无法与甘蓝型油菜基因组比对，2对比对到甘蓝型油菜C9染色体上，1对比对到甘蓝型油菜C4染色体上；1对SSR标记比对到甘蓝型油菜C3染色体上。从上面结论看出，传统的方法无法快速定位，利用重测序技术对雌雄不育植株和纯合可育植株进行BSA(集团分离分析法)测序，各取20个单株，得到三个差异区间，都在甘蓝型油菜C3染色体上。根据重测序结果获得的三个差异区间的SNP设计InDel标记以及1对SSR引物2Mb范围内设计SSR引物共220对，获得11对多态性标记(InDel标记6对，SSR标记5对)，其中重测序的两个区间没有多态性标记，排除这两个区间，限定在1.11Mb(45.34-46.45Mb)的区间内。现有技术存在的问题及解决方法：由于得到雌雄不育突变体为隐性突变，而且雌雄都不育，所以只有杂合单株通过自交，才能分离出不育单株，另外，筛选得到的多态性标记在955株不育单株中验证，有较高的交换率，这可能与F2衍生群体有较大的遗传背景噪音引起的。通过基因组重测序和转录组测序以及结合传统的标记分析，能够确定雌雄不育候选基因。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法。雌雄不育的甘蓝型油菜在油菜中未见报道，对雌雄不育的基因可能为未知基因或者是一个新功能的基因。通过分子标记筛选结合基因组重测序技术确定候选区间，结合候选区间的基因功能确定雌雄不育的候选基因。本专利技术是这样实现的，利用1536对AFLPs(EcoRI/MseI,PstI/MseI,ScaI/MseI)标记和917对SSR标记(来源于http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php,http://brassicadb.org/brad/geneticMarker.php)在2:2(不育：可育)混池(各取10株)的F2衍生群体(近等基因系)中筛选，得到7对AFLP标记和1对SSR标记有多态性。在614株单株中也能找到多态性。7对AFLP标记测序后Blast分析，其中4对无法与甘蓝型油菜基因组比对，2对比对到甘蓝型油菜C9染色体上，1对比对到甘蓝型油菜C4染色体上；1对SSR标记比对到甘蓝型油菜C3染色体上。从上面结论看出，传统的方法无法快速定位，利用重测序技术对雌雄不育植株和纯合可育植株进行BSA(集团分离分析法)测序，各取20个单株，得到三个差异区间，都在甘蓝型油菜C3染色体上。根据重测序结果获得的三个差异区间的SNP设计InDel标记以及1对SSR引物2Mb范围内设计SSR引物共220对，获得11对多态性标记(InDel标记6对，SSR标记5对)，其中重测序的两个区间没有多态性标记，排除这两个区间，限定在1.11Mb(45.34-46.45Mb)的区间内。一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选所用引物的序列为：SEQIDNO：1-SEQIDNO：22。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的方法，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：步骤一，不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：由于雌雄不育材料，利用杂合可育单株连续套袋自交获得F7-F9群体进行定位；步骤二，已公布的标记对不育系Bnmfs的不育基因进行初步定位：筛选与不育系Bnmfs的不育基因连锁的分子标记，进行初步定位，定位在染色体上；已公布的标记是指AFLP标记和已知引物序列的SSR标记；步骤三，开发新的分子标记：根据不育系Bnmfs的不育基因所在染色体的区间序列用SSRHunter1.3软件检测SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物；InDel标记是根据重测序在该区间的SNP设计；步骤四，缩小不育系Bnmfs的不育基因在染色体的区间：用新的SSR标记和InDel标记对不育系Bnmfs的不育基因进行定位，缩小不育基因在染色体上的区间；步骤五，共显性标记筛选：对新的分子标记在F8-F9群体中进行共显性标记筛选。本专利技术的另一目的在于提供一种使用所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物鉴定甘蓝型油菜可育株的纯合和杂合。本专利技术通过已经筛选得到的一对SSR标记以及基因组重测序获得的三个区间(C3：35.40-35.68Mb、35.74-35.75Mb、45.34-46.45Mb)的SNP，设计220对InDel和SSR引物，获得11对有多态性的引物。12对引物条带清楚，并且除了InDel45标记外，都是共显性标记，并在955株不育单株中得到验证。这些标记与不育系Bnmfs的不育基因紧密连锁。本专利技术筛选的分子标记是不育系Bnmfs的不育基因两侧紧密连锁的标记，缩小了不育基因在甘蓝型油菜染色体的区间，为后续该基因的克隆奠定基础；筛选的分子标记，特异性强、稳定性高，并且标记的筛选方法操作简单；筛选了共显性标记，能鉴别分离群体中显性纯合、杂合和隐性纯合单株，可以克服传统育种依靠表型进行选择的特点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快育种进程。表1多态性标记的位置附图说明图1是本专利技术实施例提供的甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的重测序差异区间示意图。图3是本专利技术实施例提供的标记连锁示意图。图4是本专利技术实施例提供的SSR19标记共显示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术通过发掘新的分子标记，构建遗传连锁图，确定不育系Bnmfs的不育基因在染色体上的位置，为后续候选基因选择以及该基因在育种上应用提供理论支撑。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物，其特征在于，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的引物的序列为：SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：22。

【技术特征摘要】
1.一种甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物，其特征在于，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的引物的序列为：SEQIDNO：1-SEQIDNO：22。2.一种利用如权利要求1所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs利用分子标记筛选的引物及方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜雌雄不育系Bnmfs分子标记筛选的方法包括以下步骤：步骤一，不育系Bnmfs的不育基因定位群体构建：由于雌雄不育材料，利用杂合可育单株连续套袋自交获得F7-F9群体进行定位；步骤二，已公布的标记对不育系Bnmfs的不育基因进行初步定位：筛选与不育系Bnmfs的不育基因连锁的分子标记，进行初步定位，定位在染色体上；已公布的标记是指AFLP标记和已知引物序列的SSR标记；步骤三，开发新的分子标记：根据不育系Bnmfs的不育基因所在染色体的区间序列用SSRHunter1.3软件检测SSR位点，并使用Primer5软件设计SSR引物；InDel标记是根据重测序在该区间的SN...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕长才，杜德志，赵志刚，唐国永，徐亮，赵志，姚艳梅，星晓蓉，郭少敏，
申请(专利权)人：青海省农林科学院，
类型：发明
国别省市：青海,63