植物转化的改良方法技术

将ＤＮＡ片段整合进单子叶植物细胞基因组中的方法，该过程包括的步骤有：１）与ＤＮＡ片段接触之前，在含有植物酚类化合物的培养基上培养未转化单子叶植物细胞的培养物一段时间，其时间足以刺激细胞分裂并增强外源ＤＮＡ的整合能力；并且２）在所述ＤＮＡ片段被未转化细胞吸收且稳定整合进未转化细胞基因组中的条件下，使未转化细胞与ＤＮＡ片段相接触，产生转化细胞。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
(ⅰ)专利
本专利技术涉及植物细胞、特别是单叶子植物细胞、更具体为玉米、水稻、小麦和大麦细胞的组织培养以及获得遗传转化植物细胞和植物的改良方法。(ⅱ)相关技术描述在过去的几年中已发展起许多植物的遗传转化技术。这些方法的最终目的是获得转基因植物，其所有细胞都含有包含稳定整合到其基因组、尤其是核基因组中的目的基因的外源DNA(所谓的转基因)。转化是一个复杂的过程，它总是包括使起始细胞与通常含有一个或多个外源目的基因的DNA接触。细胞与DNA的接触在有利于细胞吸收包括目的基因的DNA并将其整合入细胞基因组中的条件下进行。用于转化的起始细胞通常是离体培养过一段时间的细胞。细胞与DNA接触之后，转化细胞一般需离体培养特定时期以便于从非转化细胞中分离转化细胞，并从转化细胞再生转化植株。不同的植物转化方法已有所描述，并可划分为DNA直接转化法(例如电穿孔、PEG介导的DNA吸收、生物发射(biolistics))或农杆菌介导的DNA转移。Vasil(1994)和Christou(1994)综述了适合的禾谷类植物转化方法。农杆菌介导的DNA转移是DNA转移到植物细胞的最有效方式之一，且需要不同转化方法中所需的大概最少的技术硬件。此外在定量上，从农杆菌介导的DNA转移获得的转化植物的优越性在于，包含有较少数目的插入染色体上不同位置的转基因，并且较少发生转基因畸变。农杆菌介导的植物DNA转化基于某些农杆菌菌株具有使其Ti质粒的一部分(即T-DNA)导入植物细胞并将该T-DNA整合进细胞核基因组的能力。发现转移和整合的Ti质粒的部分已由特定DNA序列-即所谓的T-DNA左边界序列和右边界序列所标示，并且位于这些边界序列之间的天然T-DNA序列能够被外源DNA所取代(欧洲专利公告“EP”116718；Deblaere等，1987)。农杆菌介导的单子叶植物转化已被多次报道(参见下文)。但是所报道方法的应用局限于特定的种或基因型，或需要使用特殊织组或特定农杆菌菌株。对于大多数报道的方法，转化率仍可大大提高。Hooykaas-Van Solgteren等(1984)描述了对两个用致瘤型农杆菌菌株感染的单子叶种吊兰(Chlorophytum capense)和水仙属栽培品种‘Paperwhite’中Ti质粒基因表达的检测。Hernalsteens等(1984)和Bytebier等(1987)描述用天然的根癌农杆菌分离菌，以及用包含非致癌型T-DNA的根癌农杆菌菌株对石刁柏(Asparagus officinalis)的转化。美国专利5,164,310号描述通过用根癌农杆菌接种切离的或培养的植物茎尖而转化植物(包括玉米和小麦)的方法。美国专利5,187,073号和5,177,010号描述了在幼苗含有快速分裂细胞的区域制造创伤并用Vir+根癌农杆菌接种伤口的产生转化禾本科(玉米)的方法。PCT专利公开WO 92/09696描述利用单子叶植物(如玉米和水稻)的致密型胚发生愈伤组织(玉米中的Ⅰ型愈伤组织)和未成熟幼胚(机械性致伤或酶消化性致伤)作为转化过程的起始材料。EP 0604662 Al描述用含有所需基因的农杆菌属细菌在脱分化下或脱分化后的单子叶植物培养组织进行转化。EP 0672752 Al描述用农杆菌转化单子叶植物未脱分化的未成熟胚盾片(scutulum)。两个专利均描述利用的农杆菌菌种除具有Ti质粒或Ri质粒之外，还具有包含来源于Ti质粒pTiBo542毒性区的DNA片段。Raineri等(1990)描述用农杆菌介导的基因转移系统，对盾片区受创伤的两种水稻栽培品种的胚来源培养物进行转化。Chan等(1993)描述在含有番茄悬浮培养细胞的培养基上，用农杆菌菌株接种，对在存在2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的条件下已培养2天的水稻未成熟胚进行转化。Mooney等(1991)描述通过农杆菌介导将卡那霉素抗性基因导入酶处理的小麦胚中的方法。已有报道，在共培养之前通过细菌与乙酰丁香酮温育，诱导农杆菌菌株的Ti质粒或辅助质粒的vir基因以增强转化，并在植物细胞与细菌共培养期间添加乙酰丁香酮(Van Wordragen和Dons,1992；Jacq等1993；James等，1993)。Guivarc’h等(1993)描述通过用乙酰丁香酮短暂预处理胡萝卜根圆盘10分钟，进行瞬时农杆菌介导转化胡萝卜根圆盘的改进。本专利技术概述和目的提供了将DNA片段整合进单子叶植物、尤其是玉米、水稻、小麦或大麦细胞基因组中的方法，包括以下步骤1)与DNA片段接触之前，在含有植物酚类化合物的培养基上，特别是在含有选自乙酰丁香酮、α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、β-resorcglic acid、原儿茶酸、焦性没食子酸(pyrrogallic acid)、没食子酸及香草醛的植物酚类化合物的培养基上，培育未转化单子叶植物细胞的培养物，其培养时间足以刺激细胞分裂并增强外源DNA的整合能力，时间最好为大约1至10天，特别是大约4至5天；并且2)在所述DNA片段可被未转化细胞吸收且稳定整合进未转化细胞基因组中的条件下，尤其是通过电穿孔、用聚乙二醇的直接基因转移、用DNA包裹微粒的轰击或用含有所述DNA片段的农杆菌菌株共培养，使未转化细胞与DNA片段相接触，产生转化细胞。可选地使转化细胞再生成转基因单子叶植物。还提供了将DNA片段整合进玉米植株细胞基因组中的方法，包括以下步骤在与所述DNA片段相接触之前，将Ⅰ型愈伤组织、最好是已切成片段的Ⅰ型愈伤组织、特别是最大长度为0.5-5 mm的片段与植物酚类化合物温育一段时间，其时间足以刺激所述细胞分裂并增强外源DNA整合的能力，最好约1至10天，特别是约4至5天，其中所述植物酚类化合物尤其是选自乙酰丁香酮、α-羟基-乙酰丁香酮、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、β-resorcylic acid、原儿茶酸、焦性没食子酸、没食子酸及香草醛的植物酚类化合物；或者在与D所述NA片段接触之前，在将Ⅰ型愈伤组织切成片段、尤其是切成最大长度为0.5-5 mm的片段之前，将所述Ⅰ型愈伤组织在含有植物酚类化合物的培养基上温育一段足以刺激细胞分裂并增强外源DNA整合能力的时间；并且2)在所述DNA片段可被未转化细胞吸收并稳定整合进未转化细胞基因组的条件下，尤其是通过电穿孔、用聚己二醇的直接基因转移、用DNA包裹微粒的轰击或用含有所述DNA片段的农杆菌菌株共培养，使DNA片段与未转化细胞相接触，产生转化细胞。也提供了在存在植物酚类化合物时提高单子叶植物稳定转化频率的方法，其中所述的植物酚类化合物包含于在外源DNA与培养组织相接触之前植物细胞培养的培养基中。还提供了含有至少两种植物酚类化合物的植物培养基组成。最佳实施方案详述本专利技术基于以下的最初观察，即在含有如乙酰丁香酮的植物酚类化合物的培养基上，培养植物愈伤组织、特别是玉米愈伤组织、更特别是精细切割的玉米Ⅰ型愈伤组织碎片大约5天，极大地刺激了细胞分裂，产生通过农杆菌介导的转化将转移入细胞的外源基因整合进基因组的能力增强的可育愈伤组织，正如在标准条件下回收的转化细胞及转化植株的数目所反映的。本处所用的“未转化细胞”指未与应用本专利技术方法时使本文档来自技高网...

【技术保护点】
将ＤＮＡ片段整合进单子叶植物细胞基因组中的方法，所述方法包括以下步骤： １）与ＤＮＡ片段接触之前，在含有植物酚类化合物的培养基上培养未转化单子叶植物细胞的培养物一段时间，其时间足以刺激细胞分裂并增强外源ＤＮＡ的整合能力；并且 ２）在所述ＤＮＡ片段被未转化细胞吸收且稳定整合进未转化细胞基因组中的条件下，使未转化细胞与ＤＮＡ片段相接触，产生转化细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：K德哈瑞恩，
申请(专利权)人：植物遗传系统有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]