包含功能性剪接供体位点和功能性剪接受体位点的反转录病毒载体制造技术

描述了一种反转录病毒载体。所述反转录病毒载体包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点的反转录病毒载体；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列（“ＮＯＩ”）其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列（“ＮＳ”）和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二ＮＳ；其中所述第一ＮＳ位于所述第二ＮＳ下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及载体。具体地说，本专利技术涉及用于包装并表达反转录病毒颗粒中的遗传物质的新系统。更具体地讲，本专利技术涉及能够表达反转录病毒颗粒的新系统，它能够将目的核苷酸序列(下文缩写为“NOI”)或甚至多种NOI传递至一个或多个靶位点。另外，本专利技术特别涉及可用于基因治疗的新型反转录病毒载体。基因治疗可以包括以下的任何一种或多种形式例如在一个或多个靶位点诸如靶细胞中对一种或多种核苷酸序列进行加入、取代、缺失、补充、操作等。如果所述靶位点为靶细胞，则所述细胞可以为组织或器官的部分。在Molecular Biology(编辑Robert Meyers，Pub VCH，诸如第556—558页)中可以找到关于基因治疗的的一般内容。作为再一实例，基因治疗也可以提供用于以下任何一种或多种目的的方法可以应用诸如基因的核苷酸序列以取代或补充缺陷基因；可以消除致病核苷酸序列，诸如基因或其表达产物；可以加入或引入核苷酸序列，诸如基因或其表达产物，以便例如产生更合适的表型；可以加入或引入核苷酸序列，诸如基因或其表达产物，例如用于选择目的(即在非转化细胞上选择转化细胞等)；可以在分子水平上操作细胞，以治疗、治愈或预防疾病病症—诸如癌症(Schmidt—Wolf和Schmidt—Wolf，1994，Annals of Hematology 69，273—279)或其它疾病病症，诸如免疫疾病、心血管疾病、神经病、炎症疾病或传染病；可以操作抗原和／或将其引入以诱发免疫应答，诸如基因疫苗接种。在最近数年中，已经提出将反转录病毒用于基因治疗。本质上说，反转录病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。在该方面，反转录病毒是通过DNA中间体复制的感染性实体。当反转录病毒感染细胞时，其基因组由反转录酶转变为DNA形式。所述DNA拷贝用作模板，以产生新的RNA基因组和感染性病毒颗粒装配所必需的病毒编码的蛋白。有许多反转录病毒，实例包括鼠类白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉纳米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo—MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FRB MSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo—MSV)、艾贝尔逊鼠类白血病病毒(A—MLV)、鸟类髓细胞瘤病病毒—29(MC29)和鸟类成红细胞增生病毒(AEV)。在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring Harbour LaboratoryPress编辑JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第758—763页)中，可以找到详细的反转录病毒一览表。在本领域中可以找到关于某些反转录病毒基因组结构的细节。作为实例，可以从NCBI Genbank中可以找到关于HIV的细节(即基因组登记号AF033819)。所有野生型反转录病毒基本上均含有三种主要的编码域—gag、pol、env，它们编码必需的病毒体蛋白。然而，反转录病毒可以大致分为两类即“简单的”和“复杂的”。这些类别的区别在于其基因组结构。简单的反转录病毒通常仅携带基本信息。相比之下反，复杂的反转录病毒也编码得自多重剪接信息的另外的调节蛋白。反转录病毒甚至可以进一步分为7组。其中5组代表具有致癌潜力的反转录病毒。其余2组是慢病毒和泡沫病毒。这些反转录病毒的综述出现于“Retroviruses”(1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press编辑JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus第1—25页)。除人T细胞白血病病毒—牛白血病病毒群(TLV—BLV)外的所有致癌成员均为简单的反转录病毒。HTLV、BLV和慢病毒以及泡沫病毒是复杂的反转录病毒。研究得最清楚的一些致癌反转录病毒是劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)和鼠类白血病病毒(MLV)和人T细胞白血病病毒(HTLV)。慢病毒群甚至再分为“灵长类”和“非灵长类”慢病毒。灵长类慢病毒的实例包括人免疫缺陷病毒(HIV)(即人自身免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括原型“慢病毒”维斯那／梅迪病毒(VMV)以及相关的山羊关节炎—脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和新近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒。慢病毒科和其它类型反转录病毒之间的不同之处在于，慢病毒具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力(Lewis等1992 EMBO．J 113053—3058；Lewis和Emerman 1994 J．Virol．68510—516)。相比之下，诸如MLV的其它反转录病毒不能感染非分裂细胞，诸如构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织的细胞。在感染过程中，反转录病毒最初附着于特定的细胞表面受体。在进入敏感性宿主细胞时，反转录病毒RNA基因组则由亲代病毒内携带的病毒编码的反转录酶拷贝为DNA。该DNA被转运到宿主细胞核，随后在核内整合入宿主基因组。在此阶段，它通常被称为原病毒。在细胞分裂期间，原病毒稳定地存在宿主染色体上，并同其它细胞蛋白一样被转录。原病毒编码制造更多病毒所需的蛋白和包装机器，病毒可以通过有时称为“芽生”的过程离开细胞。正如已经表明的，每个反转录病毒基因组均包含称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒体蛋白和酶。在原病毒中，这些基因两端的侧翼为称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒的整合和转录。它们也作为增强子—启动子序列而起作用。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。反转录病毒RNA的包衣壳借助于位于病毒基因组5’端的psi序列而发生。LTR本身是相同的序列，它们可以分为三种元件，这些元件称为U3、R和U5。U3得自所述RNA 3’端特有的序列。R得自于所述RNA两端重复的序列，而U5得自所述RNA 5’端特有的序列。在不同反转录病毒中，这三种元件的大小可以显著变化。为了易于理解，以下显示RNA和DNA形式的所述反转录病毒的简单的一般结构(未按比例制图)，其中显示了LTR的基本特征和gag、pol和env的相对定位。病毒体DNA 如上图所示，传染性反转录病毒RNA基因组的基本分子结构是(5’)R—U5—gag，pol，env—U3—R(3’)。在缺陷型反转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可能不存在或没有功能。该RNA两端的R区是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’端特有的序列。病毒体RNA反转录为双链DNA发生于细胞质中，涉及反转录酶从模板分子的5’末端至3’末端的两次跳跃。这些跳跃的结果是位于病毒体RNA 5’和3’端的序列复制。然后这些序列在病毒DNA两端发生串联融合，形成包含R U5和U3区的长末端重复序列(LTR)。反转录完成时，病毒DNA易位到细胞核中，在此称为前整合复合物(PIC)的反转录病毒基因组的线性拷贝，借助病毒体整合酶随机插入染色体DNA中，形成稳定的原病毒。整合入宿主细胞基因组中的可能位点的数目非常大并且分布非常广。原病毒转录的控制主要归于病毒LTR的非编码序列。转录起始位点位于左手边LTR(未显示)中U3和R之间的边界，poly本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含一个功能性剪接供体位点和一个功能性剪接受体位点的反转录病毒载体；其中所述功能性剪接供体位点和所述功能性剪接受体位点邻接一个第一目的核苷酸序列（“ＮＯＩ”）；其中所述功能性剪接供体位点位于所述功能性剪接受体位点上游；其中所述反转录病毒载体衍生自反转录病毒原载体；其中所述反转录病毒原载体包含一个能够产生所述功能性剪接供体位点的第一核苷酸序列（“ＮＳ”）和一个能够产生所述功能性剪接受体位点的第二ＮＳ；其中所述第一ＮＳ位于所述第二ＮＳ下游；使得所述反转录病毒载体因所述反转录病毒原载体的反转录而形成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：C贝冰顿，S金斯马，M乌登，A金斯马，K米特洛范诺斯，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[]