固氮菌及其菌剂、菌剂组合物和它们的应用制造技术

本发明专利技术公开了两株新的有芽孢固氮菌，它们耐干、耐热、耐盐，并有很高的固氮酶活性，可用于制备生物活性菌剂及其组合物和生物活性肥制品等。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及固氮菌的分离、纯化及其发酵制品。具体地讲，本专利技术涉及芽孢固氮菌的分离、纯化及其发酵制品，以及由所述芽孢固氮菌及其组合物用于制备生物活性肥制品的应用。众所周知，氮是一种重要的生命元素，如何给植物尤其是经济农作物提供安全有效的氮肥一直是人们所关心的问题。含氮化肥在给农业带来巨大益处的同时，也带来造成土地板结、生态破坏、产品质量下降的缺陷。1972年，有机农业联盟就发出了“停止使用含氮化肥”的呼吁。自1895年出现了第一种生物肥料一根瘤菌接种剂以来，国内外已开发出很多种基于固氮菌的生物肥料。这些肥料中的固氮菌根据其与植物的生长关系，可分成以下三类1.共生固氮菌，其代表性的例子是根瘤菌。该类微生物与豆科植物构成共生关系，根瘤菌侵入豆科植物的根部，并使植物在被侵入部位生成根瘤。根瘤菌将空气中游离态的氮固定并转化为植物可利用的氮，而植物也为固氮菌提供了生长繁殖的环境与营养。2.联合固氮菌，其代表性的例子是巴西固氮螺菌。这类菌可以进入植物根部细胞，但并不致瘤。3.自生固氮菌，其代表性的例子是圆褐固氮菌。这类菌不侵入植物细胞，而与植物成相互独立的关系。这种菌可将空气中的氮固定转化为植物可利用的氮，并将之富集在土壤中。目前开发出的基于以上三类固氮菌的生物肥料却各自存在着不足之处。例如，基于根瘤菌的生物肥料其应用范围受到了根瘤菌宿主范围的限制，这类生物肥料一般只适用于豆科植物，而对非豆科植物是无效的。而且，由于现有的自生固氮菌、联合固氮菌和根瘤菌均没有芽孢，因此它们不耐热、不耐干，使基于这三类固氮菌的生物肥料存在着有效菌易死亡、易生杂菌、保存时间短和不便运输的缺点。为克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术的专利技术人致力于分离、筛选和纯化有芽孢的固氮菌；经过数年的努力他们终于得到了两株耐热、耐干、耐盐、有芽孢的固氮菌。基于这两株固氮菌，还分别开发出了菌剂、菌剂组合物和生物活性肥制品。本专利技术的目的在于提供一种能耐热、耐干、耐盐、有芽孢的固氮菌。本专利技术的另一目的是提供一种由上述本专利技术固氮菌经发酵制成的菌剂。本专利技术的又一目的是提供一种含有上述本专利技术固氮菌剂的菌剂组合物。本专利技术的再一目的在于提供一种含有上述本专利技术固氮菌和/或本专利技术固氮菌剂的生物活性肥制品。本专利技术包括如下几个方面1.本专利技术的固氮菌本专利技术的固氮菌是于1999年月日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的ND1和ND2。ND1和ND2的保藏编号分别为CGMCC--和CGMCC--。ND1是一种球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。ND2是一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。这两种固氮菌的最适生长温度为28-32℃，并可耐受80℃的高温达1-3小时；可耐受20％的(NH4)2SO4；最适pH为6.8-7.2。保存培养基为Dǒbereiner低氮培养基。本专利技术的上述两株固氮菌不但具有很强的固氮酶活性，还具有较强的解析金属元素如磷、钾的能力和分泌激素的能力。2.本专利技术的固氮菌液剂和粉剂本专利技术的固氮菌菌剂是通过将本专利技术固氮菌依次经斜面培养、种子瓶培养、发酵培养制成的。一种固氮菌剂是本专利技术的ND1的发酵培养液，其中含有约1.0×108-2.0×109个ND1/毫升。向该固氮菌剂中添加载体，再经过滤/离心、干燥、粉碎、过筛，可制得粉状的含ND1的固氮菌剂(下文称之为ND1粉剂)，该固氮菌剂中的有效活菌总数为约5.0～7.0×108-1.0～1.4×1010个ND1的细胞/克，优选含有至少约7.0×109个ND1的细胞/克。本专利技术的另一种固氮菌剂是本专利技术的ND2的发酵培养液，其中含有1.0×107-4.0×108个ND2/毫升。向该固氮菌剂中添加载体，再经过滤/离心、干燥、粉碎、过筛，可制得粉状的含ND2的固氮菌剂(下文称之为ND2粉剂)，该固氮菌剂中的有效活菌总数为约5.0～7.0×107-2.0～2.8×109个ND2的细胞/克，优选含有至少约2.0×108个ND2的细胞/克。对所述的过滤/离心、干燥、粉碎、过筛等步骤没有特殊的要求，可使用本领域已知的任何适当的方法和设备，只要能达到所需的目的即可。所述粉剂的粒径大小为60-100目，优选80-100目。所述的载体为碳酸钙、高岭土、膨润土中的一种或多种的混合物。优选采用碳酸钙作载体。本专利技术的固氮菌剂除了可以用来制备本专利技术的活性菌剂组合物，进而制备生物活性拌种剂、生物活性菌粒、生物活性复混肥或颗粒掺混肥外，很显然的是，它们亦可作为肥料而直接应用于农业生产。3.本专利技术的活性菌剂的组合物本专利技术还提供一种生物活性菌剂的组合物，该组合物含有下面四种菌粉剂中的至少两种上述ND1的粉剂、上述ND2的粉剂、有芽孢解磷菌如由中国农业大学提供的ND3的粉剂和有芽孢解钾菌如由中国农业大学提供的ND4的粉剂，其中，上述有芽孢解磷菌的粉剂和有芽孢解钾菌的粉剂的制备和本专利技术固氮菌菌剂的制备方法类似，即在经发酵培养后加载体、制成滤饼或离心得沉淀，然后烘干和粉碎过筛制成。其他各粉剂与上述ND1粉剂的配合比例为0.5～1∶1，优选按1∶1配合。例如，可将ND1的粉剂、ND2的粉剂按1∶(0.5～1)的比例混合。如果本专利技术的生物活性菌剂的组合物包含上述四种活性菌，则其中ND1∶ND2∶解磷菌∶解钾菌的比例为1∶(0.5～1)∶(0.5～1)∶(0.5～1)，优选按1∶1∶1∶1的等比混合。同时含有ND1的粉剂和ND2的粉剂的本专利技术混合菌剂是优选的。本专利技术对上述菌剂的混合次序、混合方式没有限制，只要能将个组分混合均匀即可。当然，可以想见，可将各菌先单独发酵，然后将各发酵液按预定比例混合，再经添加或不添加载体，而制成所需的混合菌剂；也可将各菌首先混合发酵培养，然后加载体制成混合菌剂。例如，可将本专利技术的两种固氮菌按比例混合培养发酵，再采用与制备单一固氮菌粉剂同样的方法来制备本专利技术两种固氮菌的混合粉剂。在本专利技术的上述生物活性菌剂的组合物中，有效活菌的总数为3.0×109～1.2×1010/克，其中优选有效活菌总数大于或等于7.0×109/克。本专利技术的上述生物活性菌剂的组合物，粒径一般为60-100目，优选为80-100目。上述菌剂组合物可作为肥料直接使用，但是优选将所述菌剂组合物经一定比例的稀释后再施用，如加水制成混悬液后喷洒、浇灌，或与其他有机质、中微量元素、和/或化肥的粉末掺混后施用。4.本专利技术固氮菌剂或其组合物用于制备生物活性肥料a.用于制备生物活性拌种剂可选用工业、农业、生活废弃的和自然的有机物(如污泥、垃圾、粪便、秸杆，以及河湖塘泥、草炭等)为载体，并采用磷酸二氢钾、腐植酸钾、中微量元素等为营养成分，以300-500℃对载体、营养成分进行高温灭菌细粉碎达到60-100目，优选80-100目；然后进行二次灭菌；在无菌条件下按照配方，即，按活性菌粉剂(载体+营养成分)为1∶10～30的比例进行掺混。成品为松散粉末状固体，粒径大小为60-100目，优选为80-100目，有效活菌数至少为4.0×108/克，含水分5％以下，所含有机质以C.计至少为30wt％，杂菌率为不高于15％。该组合物产品可用于拌种。b.用于制备生物活性菌粒也可将本专利技术的活性菌粉剂进一步配制成制备生物活性肥制品用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固氮菌ＮＤ１，是一种球型芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ），其保藏编号为ＣＧＭＣＣ－－－－－。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔宗均，程又明，谢光辉，曾飞，
申请(专利权)人：中国华联国际服务联合有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]