一种制备异枝江蓠原生质体的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备异枝江蓠(Gracilaria bailinae)原生质体的方法，本发明专利技术的方法通过培养海洋细菌Marinomonas sp.YS‑70发酵产生琼胶酶粗酶液，混合纤维素酶、离析酶及添加缓冲介质和渗压剂组成原生质体分离液，对经过消毒、切碎的异枝江蓠藻体进行酶解处理，使其释放出游离原生质体。本发明专利技术采用异枝江蓠原生质体的分离的琼胶酶，其中包含多种酶活性，产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效。离析酶与纤维素酶和琼胶酶互相配合起协同作用，效率高，所需时间短，仅需要解离4h，可得到大量的原生质体，有利于提高原生质体的产量及其存活率。解离后原生质体活性强，后续的培养存活率高及细胞壁再生能力强。而且本发明专利技术的异枝江蓠不需要预处理，有利于节省成本。

A method for preparation of protoplasts of Gracilaria branch

The invention discloses a preparation of Gracilaria branch (Gracilaria bailinae) protoplast, the method of the invention by producing agarase enzyme fermentation of 70 marine bacteria Marinomonas sp.YS mixed culture, cellulase, macerozyme and buffer medium and osmoticum composition of protoplast isolation solution on different branches Gracilaria after disinfection, chopped by enzymatic treatment, the release of protoplasts. The invention adopts the separation of agarase Gracilaria protoplast branch, which contains a variety of enzyme activity, yield, can make the cell wall dissociation fully, low cost and high efficiency. Macerozyme and cellulase and agarase cooperate with each other to play a synergistic effect, high efficiency, short time, only need to get the protoplast dissociation of the 4h, a lot of help to improve the protoplast yield and survival rate. After the dissociation, the protoplast activity is strong, the survival rate of subsequent culture is high and the cell wall regeneration ability is strong. But the different branches of Gracilaria does not require pretreatment, thus saving the cost.

【技术实现步骤摘要】
一种制备异枝江蓠原生质体的方法
本专利技术涉及一种制备大型海藻的原生质体的方法，特别涉及一种制备异枝江蓠原生质体的方法。
技术介绍
异枝江蓠(Gracilariabailinae)是我国南方沿海的一种经济海藻，可作为鲍鱼的饵料和提取琼胶的原料。有报道发现异枝江蓠适合生长的温度为23～33℃，适合生长的盐度为18～28，有适应广温和广盐的性质。具有氮高效利用的营养特征，由于其具有生长快、有耐受广温和广盐等特性，近年来已经在我国广东、福建等地进行栽培。异枝江蓠的生活史是，四分孢子体成熟后在皮层细胞形成许多四分孢子囊，且每个四分孢子囊中有四个经减数分裂产生的四分孢子。四分孢子放散之后，发育成雌、雄配子体。雌配子体性成熟后形成果孢，雄配子性成熟之后形成精子囊，大量的精子从精子囊释放后游离到雌配子体上，然后生殖细胞结合形成合子，合子在雌配子体的表面发育出凸起的囊果，即形成果孢子体。果孢子体成熟后放散并发育成四分孢子体，完成世代交替的生活史。由于目前异枝江蓠的栽培生产是采用传统方式进行种质保存和培养，即采用藻体进行营养繁殖，这种方法需要耗费大量藻体作为种苗，且这些种苗若保存在室内，则因为保存数量有限，难以实现大规模生产栽培，若保存在海区，则种苗容易受到自然环境的影响，苗种产量难以进行控制，因此需要建立起异枝江蓠苗种培育技术体系，以应用于栽培生产。原生质体的分离、培养再生是植物组织培养技术中的两种重要的手段，利用原生质体再生的方法快速繁殖植物，已在高等植物生产应用上取得成效。在大型海藻方面，只有将常规育苗技术改变成为细胞工程育苗技术，能建立良种保存、扩繁、育苗和栽培的良种化技术体系，实现海藻的良种化生产，这也将成为今后大型海藻人工栽培发展的新趋势。本专利技术技术对异枝江蓠建立一种可行的种质保存和组织培养的技术体系，开发苗种培育新技术，满足栽培生产对苗种的需要，对利用江蓠原生质体再生、融合等细胞工程技术进行江蓠属海藻的育种研究，均具有重要意义。江蓠的细胞壁主要由纤维素和琼胶组成，其中纤维素是同多糖，通过购买的较纯的纤维素酶很容易将细胞壁中的纤维素降解，但琼胶的组成成份很复杂，它由琼脂糖和硫琼胶组成,琼胶糖是由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的直链聚合物，结构较均一,凝胶强度高。硫琼胶由长短不一的半乳糖残基多糖链组成,结构较复杂,其中包含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和多种取代基如丙酮酸、硫酸基、甲基等，是琼脂结构中的非凝胶组分，其结构很不均一,凝胶强度低。由于江蓠的种类、生长环境和采集季节等的不同，其细胞壁中的多糖和其他物质的含量和种类也会相应变化，所含琼胶的数量及其物理化学性质变化很大，有的产琼胶率高、质量好，有的则很差。不同种江蓠的细胞壁中的琼胶含量与琼胶的凝胶强度不一样，故在降解相应的江蓠的细胞壁时，所选用的琼胶酶是关键，故在分离它们的原生质体的时候需要采用不同的手段。目前市场上卖的琼胶酶一般是经过纯化的，不能有效降解细胞壁，从而使原生质体不释放或释放量少，而且商品琼胶酶价格昂贵，成本高。ZhangS,etal.(StudiesontheisolationandcultureofprotoplastsfromKappaphycusalvarezii[J].ActaOceanologicaSinica,2014,33:114-123)公开了一种制备长心卡帕藻的原生质体的方法，他们研究发现，随着时间的增加，长心卡帕藻的原生质体产量增加，但是如果延长酶解时间原生质体的存活率却逐渐降低。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种制备异枝江蓠原生质体的方法。一种制备异枝江蓠原生质体的方法，主要包括以下步骤：1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonassp.YS-702％发酵产生琼胶酶粗酶液，储存在-80℃冰箱中；4)原生质体分离液的制备：将MES-Tris和CaCl2·2H2O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；2％w/v表示2g/100ml；5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2-3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，在pH6.5，28℃下，90r/min摇床上遮光酶解4小时，酶解后用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心处理后弃掉上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，重复离心处理多次。步骤1)中用消毒海水清洗藻体表面。步骤2)中除去异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物等附着杂质的目的是为了尽可能地消除影响原生质体的外部环境干扰因素。选择异枝江蓠截取尖端3厘米原因之一在于该处藻体细胞分化程度低、活性强，转化成原生质体后活力强、分化能力高。步骤4)中若不加MES-Tris和CaCl2·2H2O，则原生质体的产量变少，原生质体无细胞壁，CaCl2·2H2O可以作为质膜保护剂保护原生质体的细胞膜，使其处于稳定状态，使原生质体相对不那么容易破裂；原生质体因为无细胞壁，对渗透压敏感，因此以0.4M山梨醇为渗压剂；若改变酶的比例，则原生质体产量也将改变，本专利技术已经优化了酶浓度，得到这是一个最佳的配比。纤维素和琼胶酶对异枝江蓠的原生质体的分离都是缺一不可的，只用纤维素酶或琼胶酶不能有效分离出异枝江蓠的原生质体，离析酶与纤维素酶和本专利技术提取的琼胶酶互相配合起协同作用，可以促进原生质体的解离。步骤5)中pH影响酶的活性，调节pH值主要是使解离细胞壁的酶达到一个最佳的解离水平，本专利技术所用纤维素酶的最适pH为5.0，离析酶R-10的最适pH为5.0～6.0。本专利技术中分离出来的琼胶酶最适pH为5.5～8.5，自然界中的海水pH一般在8左右，是江蓠正常生长的环境pH值，若解离酶液的pH越小，自然对江蓠细胞不利。本专利技术通过大量实验探索分析发现，pH6.5时能得到原生质体的最大产量。高低温都会影响酶的活性，亦会影响细胞活力，本专利技术所得原生质体制备最适温度为28℃。酶解时间对原生质体的数量和成活率有影响，时间长，原生质体数量多，但存活率低，时间短，原生质体存活率高但数量低，在酶解4小时，原生质体的数量与存活率的乘积达到最大。步骤5)中的温度及震荡转速为恒温摇床培养箱控制。对于海藻来说，藻段越小，与酶解液接触越充分越有利于原生质体的产量；但是藻段越小，因剪切力受到伤害的细胞也越多，原生质体的存活率也越低。本专利技术先截取异枝江蓠尖端3厘米，处理除去表面的杂藻及有害微生物后再切成2-3mm段。更有利于提高原生质体的产量及其存活率。而且切成3cm是因为若藻体太大则不方便清理表面的杂藻和附生物；同时切成3cm，用少量的消毒液也能完全浸没。先不把藻藻体切成2-3mm再消毒是因为若切得太小，藻体伤口越多，消毒液对藻体伤害越大。进一步的，步骤2)对样品的处理包括：用消毒海水培养5天，用超声本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonas sp.YS‑70，用2％的接种量发酵培养，产生琼胶酶粗酶液，储存在‑80℃冰箱中；4)原生质体分离液的制备：将MES‑Tris和CaCl2·2H2O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2‑3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，在pH 6.5，28℃下，90r/min摇床上遮光酶解4小时，酶解后用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心处理后弃掉上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，重复离心处理多次。

【技术特征摘要】
1.一种制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonassp.YS-70，用2％的接种量发酵培养，产生琼胶酶粗酶液，储存在-80℃冰箱中；4)原生质体分离液的制备：将MES-Tris和CaCl2·2H2O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2-3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，在pH6.5，28℃下，90r/mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟洲，陈海红，陈泽攀，张毅，石经仪，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44