杀菌/透性增加蛋白缺失类似物制造技术

本发明专利技术提供新的ＢＰＩ缺失类似物，其由成熟的人ＢＰＩ（１０到１９３位）氨基酸残基所组成，其中位于氨基酸位置（１３２）的半胱氨酸残基由另一种氨基酸所替代。同时提供了包括这些类似物的融合蛋白、编码这些产物的多核苷酸、用于其重组制备的材料与方法、这些产物的组合物及药剂以及这些产物的治疗用途。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术提供新的具有生物活性的杀菌/透性增加蛋白(BPI)缺失类似物的制剂和含有这些制剂的药物组合物，其中的新类似物特征在于具有更好的稳定性与均一性以及增强的体内活性。BPI是一种从对抵御入侵微生物至关重要的哺乳动物血细胞，称为多形核白细胞(PMN或噬中性的细胞)颗粒中分离的蛋白。已知BPI结合脂多糖，一种刺激可导致脓毒性休克(septic shock)强大免疫反应的格兰氏阴性细菌外膜蛋白的主要组分。通过酸提取结合离子交换层析或大肠杆菌亲和层析，人BPI蛋白从PMNs中得到分离。用这种方式获得的BPI在此称为天然BPI并且已显示其对广谱格兰氏阴性细菌具有强大的杀菌活性。人BPI的分子量大约55,000道尔顿(55kD)。完整的人BPI蛋白序列和编码该蛋白的DNA核酸序列报导于Gray等，生物化学杂志，264:9505(1989)的附图说明图1中，在此掺入该文献供参考。Gray等的氨基酸序列示于这里的SEQIDNO:1中。美国专利No.5,198,541(在此公开仅供参考)公开了编码BPI蛋白，包括重组BPI全蛋白(称为rBPI)和BPI重组片段的基因和用于表达这些蛋白的方法。具有大约25kD分子量的蛋白水解性BPI N-末端具有双亲性特性，含有交替的疏水及亲水区。人BPI的此N-末端拥有天然55kD人BPI全蛋白的抗菌活性。与N-末端部分相反，分离的人BPI蛋白C-末端区域对格兰氏阴性生物仅仅显示出略微可检测到的抗菌活性。一种大约23kD的N-末端BPI片段，称为“rBPI23”已由重组方法得到制备并且也维持对格兰氏阴性生物的抗菌活性。一种BPI的N-末端类似物，rBPI21，已按照Horwitz等在蛋白表达纯化，8:28-40(1996)中所述得到了制备。BPI的杀菌效应报导为对格兰氏阴性菌种类是高度特异性的，例如，在Elsbach与Weiss，发炎基本原理与临床相关性，Gallin等编，第30章，Raven出版有限公司(1992)中所述。此报导的靶细胞特异性认为是BPI对脂多糖(LPS)，格兰氏阴性生物外膜(或包被)特异性成分的强烈吸收的结果。虽然BPI通常认为对其它微生物，包括酵母和更高等的真核细胞是无毒的，但是最近发现，如下文所讨论的，BPI蛋白产物也对格兰氏阳性细胞、支原体、分枝杆菌、真菌、原生动物和衣原体表现出活性。虽然BPI杀死格兰氏阴性细菌的确切机制尚未完全阐明，但认为BPI必须首先通过带正电的BPI蛋白和LPS上带负电的位点之间的静电及疏水性相互作用而结合到该细菌的表面上。由于其刺激的强大炎症反应，即由宿主炎症细胞释放(炎症)介质，这可最终导致不可逆的内毒性休克，故LPS又称为“内毒素”。BPI与报导为LPS最具毒性的并且生物活性最强的部分，脂质A结合。在易感的格兰氏阴性细菌中，BPI结合认为打断了LPS结构，导致降解磷脂和肽聚糖的细菌酶的活化，从而改变细胞外膜的透性，并且启动最终导致细胞死亡的事件。。BPI认为在两个时期起作用。第一个称为亚致死时期，其特征为立即生长停止，穿透外膜并且选择性活化水解磷脂与肽聚糖的细菌酶类。此时期的细菌可培养于补充血清蛋白的培养基中而得到挽救。在长时间将细菌暴露于BPI之后，定义为不能够由血清蛋白所逆转的生长抑制的第二个时期发生，其特征在于广泛的生理与结构改变，包括对内膜的明显损伤。BPI与LPS的最初结合导致组织的变化，这可能是源于通过结合Mg++和Ca++而结合LPS的阴离子基团，该结合通常稳定外膜。BPI附着到格兰氏阴性细菌外膜导致疏水性药物如放线菌素D迅速穿透外膜。BPI的结合以及随后格兰氏阴性细菌的杀死至少部分依赖于LPS多糖链的长度，其中具有较长O-链的“光滑型”生物较具有短O-链的“粗糙型”生物对BPI的杀菌效应具有更强的抗性。此BPI作用的第一个时期，格兰氏阴性菌外包被的穿透在BPI解离(一种需要高浓度二价阳离子和新LPS合成的过程)时是可逆转的。然而，通过恢复包被的完整性，格兰氏-阴性细菌的存活的丧失没有得到逆转，表明该杀菌作用由在靶生物中诱导的其它损伤所介导的，并且该损伤可能位于质膜上(Mannion等，临床，研究杂志，86:631-641(1990))。对该可能性的特定研究已显示在摩尔基础上，BPI至少与多粘菌素B具有相同的质膜载体抑制功能(In′tVeld等，感染与免疫，56:1203-1208(1988))，但是确切的机制以及该载体与完整生物研究间的相关性还未得到阐明。已经表明BPI蛋白产物(包括天然和重组制备的BPI蛋白；天然、合成和重组的具有生物学活性的BPI蛋白多肽片段；具有生物学活性的BPI蛋白或其片段的多肽变异体，包括杂交融合蛋白和二聚体；具有生物学活性的BPI蛋白或其片段或变异体的类似物，包括半胱氨酸替代的类似物；和BPI衍生肽)具有多种有利的活性。已知BPI蛋白产物对格兰氏阴性细菌具有杀菌效应，如在美国专利Nos.5,198,541和5,523,288中所述，在此掺入二者供参考。同时已知BPI蛋白产物增强在格兰氏阴性细菌感染中抗生素的效应，如在美国专利No.5,523,288和相应的国际公开No.WO 95/08344(PCT/US 94/11225)中所述，在此掺入供参考。同时已知BPI蛋白产物对格兰氏阳性细菌和支原体具有杀菌效应，并且增强抗生素在格兰氏阳性菌感染中的效应，如在美国专利No.5,578,572和相应的国际公开No.WO 95/19180(PCT/US95/00656)中所述，在此引用供参考。还进一步已知BPI蛋白产物显示出抗真菌活性和增强其它抗真菌剂的活性，如在美国专利No.5,627,153和相应的国际公开No.WO 95/19179(PCT/US 95/00498)中所述，并且在共同拥有、共同未决的提交于1996年3月21日的美国申请系列No.08/621,259(其反过来又是提交于1994年7月20日的美国申请系列No.08/504,841的部分继续)和相应的国际公开Nos.WO 96/08509(PCT/US 95/09262)和WO 97/04008(PCT/US 96/03845)中进一步描述为抗真菌肽，引入所有文献供参考。还进一步已知BPI蛋白产物显示出抗原生动物活性，如在美国专利No.5,646,144和相应的国际公开No.WO 96/01647(PCT/US 95/08624)中所述，在此引入文献供参考。已知BPI蛋白产物显示出抗-衣原体活性,如在共同拥有的、共同未决的提交于1996年8月9日的美国申请系列No.08/694,843和相应的国际公开No.WO 98/06415(PCT/US 97/13810)中所述，在此引入的所有文献供参考。最后，已知BPI蛋白产物显示出抗分支杆菌活性，如在共同拥有、共同未决的提交于1996年4月1日的美国申请系列No.08/626,646(其反过来又是提交于1994年8月14日的美国申请系列No.08/285,803的部分继续，后者又成为1993年3月12日提交的美国申请系列No.08/031,145的部分继续)和相应的国际公开No.WO 94/20129(PCT/US 94/02463)中所述，所有引入的文献供参考。B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由成熟人ＢＰＩ氨基酸残基１０到１９３所组成的杀菌／透性增加蛋白（ＢＰＩ）缺失类似物，其中位置１３２的半脱氨酸残基由不同的氨基酸所替代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A霍尔维茨，FS卡罗尔，D布尔克，
申请(专利权)人：爱克索马技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]