用于反相离子对高效液相层析分离核酸的单片基质制造技术

本发明专利技术提供一种单片聚合物基质用于液相层析分离生物－有机分子。在一实例中，基质是从含以下物质的混合物聚合形成的：（ｉ）疏水单体，（ｉｉ）交联剂和（ｉｉｉ）成孔溶剂或成孔成分的混合物。本发明专利技术的单片基质特别适用于以反相离子对层析方法从样品中分离多核苷酸（如ＤＮＡ和／或ＲＮＡ）。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物-有机分子的分离。具体地说，本专利技术提供一种单片聚合物基质，用于以反相离子对的层析分离多核苷酸。
技术介绍
近年来，多核苷酸分离的重要性与日俱增。分离样品中所含的多核苷酸可用于，例如扩增反应产物DNA的检测和/或定量，和检测各种DNA(如多态性或突变)。然而主要由于这种分子的复杂结构和分子量大，至今没有一种分离技术是让人完全满意的。通常，多核苷酸的分离是用电泳技术进行的，如平板凝胶电泳，或最近的毛细管电泳。一般而言，这些方法包括将电流通过，已注入含有感兴趣的物质的混合物的介质。每种分子以不相同的速度穿过该介质，取决于它的电荷数和分子大小。但这些电泳方法也有一些缺点。例如，平板凝胶电泳的缺点是速度相对慢、检出样品困难、定量差和费人力。虽然毛细管电泳的速度较快且消耗的人力也较少，但由于毛细管性能的改变，分离不能再现且定量也差。液相层析是电泳分离方法的替代方法。通常，液相层析方法依赖于液态流动相和固定相之间分配性质的差异，据此分离混合物中的成分。由柱形管或其它支持物固定固定相，流动相则携带样品通过。被强分配入固定相的样品成分在柱中停留较多时间，并与主要呆在流动相中且较快通过柱的成分分开。各组分从柱上洗脱后，它们可用检测器定量和/或收集作进一步分析。以下为典型地用于液相层析的固定相和它们与溶质的相互作用 虽然液相层析较电泳分离方法有若干优点，但它也有自己的缺陷。大小排阻层析的缺点是分离度低，如典型地为了得到可以接受的分离度，DNA分子大小的差异必须为50-100％。虽然离子交换层析的分离度较高，但它按DNA序列组成受异常洗脱顺序的影响。而且离子交换层析中，洗脱的DNA常常受不挥发的缓冲液的严重污染，使样品的回收非常复杂。反相层析的分离度相对较高，但除非用直径特别小的颗粒作为固定相，否则它不能高速进行。用于反相层析的二氧化硅基颗粒使速度非常慢，而且在高pH条件下不稳定。聚合物颗粒不能提供样品成分的高回收或高分离速度。特别对DNA分离而言，已有的反相离子对高效液相层析(RP-IP HPLC)有限地缓解了上述部分问题。例如，RP-IP HPLC避免了带强阴离子交换剂的填料床中常常遇到的异常洗脱顺序。在RP-IP HPLC中，固定相通常是由装料到柱中的带疏水表面基团的分散颗粒形成的。洗脱液含有阳离子物质，如三乙铵离子(0.1M)，能与DNA上的带负电荷的磷酸基团相互作用，也可与柱上颗粒的疏水表面相互作用。因此，阳离子物质可视为DNA和柱之间的桥梁分子。由于流动相可制成逐渐更加有机的，如乙腈的浓度递增，可按大小洗脱DNA片段。尽管RP-IP HPLC用于DNA的分离有优点，这种方法仍然具有所有液相层析方法(将小颗粒如小珠，装入柱管中形成柱床)通常所遇到的问题。例如，颗粒分离介质的生产是复杂而耗时的。一旦制备好，将很难以可重现的和高效的方式将颗粒装入柱中。具体地说，很难填装小直径的高效柱，如直径小于1mm的柱。具有非圆截面的柱，如多边截面(如薄层或矩形)，尤其难从颗粒填料制备出来。同样，由于填料的移动和小槽或空洞的形成，填充小珠的柱也可能失去功效。另一缺陷是，用小颗粒通常导致高的柱工作压力，使柱管、泵、进样器和其它能含流体的组件的压力达到3,000psi或以上。最近的层析理论表明，对于装颗粒的柱床而言，分离效率由样品分子到固定相的物质转移的扩散距离决定。这种效应易于按用于该柱床的颗粒的已知的几何形状建立模型。按这种理论，当固定相的孔直径至少是待分离的分子的Stoke直径的3倍时，有最大分离度。这种理论是基于这样的假定，即分子将通过扩散过程被送递到固定相，而较小的孔会阻碍扩散。对于DNA分离而言，这意味着对于大小为1,000个碱基对的样品，将需要孔径至少为1微米。需要如此大的孔实际上免除了用多孔颗粒材料来装填分离DNA的支持物，因为这些基质缺少高效液相层析操作压力所需的物理强度。与多孔填料相比，由于降低了扩散距离，无孔颗粒材料特别适用于DNA的分离。对于无孔填料，以填料柱床的填隙大小确定孔径。填隙大小约为球形填料颗粒直径的1/3。为了避免捕获或剪切较大DNA分子，需要对孔径的下限作出规定。当通过用较大的颗粒时，导致效率的丧失，可定出上限。用较大的颗粒进行分离是有利的，因为只需较低的操作压力，但分离效率的降低是非常显著的。另一缺陷是，仅在密度接近约为0.4的间隙孔隙度时，才可将球形填料装成稳定的柱床。虽然更为不确定，但在孔隙度约0.4时也可将非球形填料最佳填装。此外，填装颗粒柱床有固定的表面积、固定的间隙距离和固定的压降(由填料的颗粒直径决定)。由于DNA每1,000个碱基对长度的物理大小约为0.34微米，且当间隙距离是待分离分子的Stoke直径的3-10倍时效率最高，则为1,000个碱基对DNA设计的柱所需的间隙距离为1-3微米。以3-10微米直径填料的柱可以提供这种间距。用3微米填料装填的柱使用时操作压力高，而用10微米填料装填的柱由于较长的扩散路径而效率有限，而且由于表面积的减少结合能力也较低。当柱用非常小的颗粒(如直径为1微米)填充时，可用于长度至多为300个碱基对的样品，柱操作压力会非常高，且大于300个碱基对的DNA会被剪切或捕获。典型的装填小珠的柱用直径为2.1微米的颗粒，且典型使用下的操作压力很高。上述关于填装颗粒柱床的理论对于预测连续单片柱床中大分子的表现不是特别有用的，其中物质的转移是扩散和对流过程的组合。本专利技术涉及用于分离含多核苷酸的混合物的单片柱床，它部分基于这样的发现，即单片能提供相应于使用大颗粒固定相的低压力降，同时能维持装填小球形颗粒柱的分离度。更具体地说，已发现反相单片基质能提供改良的方法来高速分离DNA分子，而且与已有的方法相比这种分离可在大大降低的操作压力下进行并得到高分离度。这一惊人的发现使得在原先不可能的条件下进行高分离度的多核苷酸分离。另外，本专利技术的单片柱可用几何结构明显区别于填料柱床的固定相构建。这种新型几何形状对大分子的分离作用是不能用现有层析理论来预测的。本专利技术的单片柱能提供先前多核苷酸分离(即烷基化无孔聚合物小珠装填的柱床)最好技术的所有优点，且无需繁重地制备小珠并将它们装填到高效柱中。本专利技术的柱用简单的方法将可制备，且一旦制备好就不会因为柱床的移动而失效，因为其中没有会漂移位置的单个小珠。除了改善的这种新型柱的易于制造和没有小珠移动以外，本文所述的单片柱比已有技术提供令人惊讶的优点，当操作压力规度化时，它们比填装小珠的柱预计的分离度至少好58％。专利技术概述本专利技术的一方面提供一种分离含至少一种多核苷酸(如DNA和/或RNA)混合物的方法。按本方法，将混合物通过由支持物以固定方式固定的单片聚合物基质。由离子对反相层析分离混合物。在一实例中，单片聚合物基质带有疏水表面基团。单片聚合物基质可由(至少部分)选自以下的聚合物构成聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯。在一实例中，聚合物是聚甲基丙烯酸酯。在一实例中，单片聚合物基质是自聚合混合物形成的，该混合物包括疏水单体、交联剂和成孔剂(porogen)。成孔剂可以是(ⅰ)成孔(porogenic)溶剂，(ⅱ)成孔溶剂的混合物，或(ⅲ)一种或多种含至少一种形成孔形的聚合物调节剂成孔溶剂。疏水单体可以是甲基丙烯酸烷酯。在一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离含至少一种多核苷酸的混合物的方法，其特征在于，所述的方法包括：将所述的含至少一种多核苷酸的混合物通过用支持物固定在固定相的单片聚合物基质，和通过离子对反相层析分离通过所述的基质的所述的混合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R哈奇，
申请(专利权)人：凡利安股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]