一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法技术

本发明专利技术公开了一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法，包括如下步骤：1)供试抗坏血酸溶液的制备；2)检测用溶液的配制；3)邻菲啰啉微量法测定抗坏血酸对羟自由基抑制率。同传统分光光度方法进行抗羟自由基活性实验相比，本发明专利技术的微量检测法在酶标仪中完成，一次可进行96个样品的检测工作，配合多通道移液器，更具有操作简便、快速减少失误的优点。

A method for detecting the inhibition rate of ascorbic acid to hydroxyl radicals by a trace method

The invention discloses a micromethod for detecting the inhibition rate of ascorbic acid on hydroxyl radical, including the following steps: 1) preparation of ascorbic acid solution; 2) preparation of detection solution; 3) determination of the inhibition rate of ascorbic acid on hydroxyl radical by the method of Phenanthroline microanalysis. Compared with the traditional spectrophotometric method, the microdetection method of the invention is completed in the enzyme labelling instrument, and 96 samples can be detected at one time, with the multi-channel pipette, which has the advantages of simple operation and fast reduction of faults.

【技术实现步骤摘要】
一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法
本专利技术涉及
，更具体的涉及一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法。
技术介绍
自由基(freeradical.FR)是具有不成对电子的原子或基团。主要有超氧阴离子自由基(O2-)、羟自由基(·OH)、脂质自由基(LO·,LOO·)和氮氧自由基(NO·)等。自由基对生物体的影响体现在两方面。一方面是有利的，适量的自由基是生物体正常生理活动所必要的，例如能够调节一些生理活动的物质代谢和免疫过程；另一方面自由基的存在具有一定的危害，高浓度的自由基会破坏细胞，对机体造成伤害。羟自由基(·OH)是一种氧化能力很强的自由基，是最活跃、进攻性最强的活性分子，几乎能够和所有的生物分子、有机物或无机物发生不同类型的化学反应，具有非常高的反应效率常数和负电荷亲电性。羟自由基(·OH)主要通过体内的Fenton反应产生，细胞中所含·OH的量与细胞内部环境的稳定性具有密切的关系。现代医学认为当·OH产生过多时，或者机体内氧自由基的清除能力下降时，能够发生电子转移、夺取氧原子和羟基化等反应，会使糖类、蛋白质、氨基酸类、核酸和脂类等发生氧化反应，遭受损伤和破坏，以致引起脑缺血、风湿性关节炎、帕金森氏症、心血管疾病和癌症等疾病。羟自由基(·OH)，是已知活性氧中对生物体具有最高的毒性和最大的危害的一种自由基，羟自由基的抑制率是衡量抗氧化剂抗氧化作用的重要指标，是抗衰老药物和许多疾病药物的筛选或高通量药物筛选最常用的初筛实验方法之一。因此，羟自由基的研究具有非常重要意义。羟自由基·OH的检测方法有很多，国内外文献报道的检测羟自由基的主要方法有：电子自旋共振(ESR)法、高效液相色谱(HPLC)法、化学发光法、荧光法等。电子自旋共振法和高相液相色谱法操作复杂，仪器昂贵；化学发光法虽然操作简单，测定快速、准确，但其目前应用的范围还不是很广范；分光光度法以设备简单、仪器便宜且精密度好等优点得到了人们广泛的应用，但该法存在工作量大，所需样品量大，操作繁琐，测定时间比较长等缺点，无法同时进行大批量药物筛选或高通量药物筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法，能够通过微量样品检测实现对羟自由基抑制率的快速检测。本专利技术是这样实现的，一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法，包括如下步骤：1)供试抗坏血酸溶液的制备：称取1.0000g抗坏血酸，定容于25mL容量瓶，浓度为：40g/L，保存于4℃的冰箱中，临用前稀释抗坏血酸溶液的浓度至5.24mg/mL；2)检测用溶液的配制：(1)制备邻菲啰啉溶液：称取0.0991g邻菲啰啉粉末，用少量纯水溶解后定容于100mL容量瓶中，浓度为：5mmol/L，临用前稀释至浓度3mmol/L；(2)制备H2O2溶液：用移液枪移取100μL浓度30％的H2O2原液，稀释300倍至浓度0.1％；(3)制备FeSO4溶液：称取0.0521g的FeSO4·7H2O固体，用含0.2mL浓硫酸的水溶解后定容于25mL容量瓶中，临用前配制且稀释至5mmol/LFeSO4溶液；(4)磷酸盐缓冲溶液：PH＝7.4，浓度1mol，购买成品，使用时去离子水稀释至0.1mol；3)邻菲啰啉微量法测定抗坏血酸对羟自由基抑制率：在96孔板依次按下述各组试剂配比，加入磷酸盐缓冲液(PBS)、邻菲罗啉溶液、硫酸亚铁溶液及抗坏血酸溶液；1、样品组PBS60μl+邻菲罗啉80μl+硫酸亚铁80μl+Vc40μl+过氧化氢40μl2、对照组PBS60μl+邻菲罗啉0μl+硫酸亚铁0μl+Vc40μl+过氧化氢0μl3、损伤组PBS60μl+邻菲罗啉80μl+硫酸亚铁80μl+Vc40μl+过氧化氢40μl4、未损伤组PBS60μl+邻菲罗啉80μl+硫酸亚铁80μl+Vc40μl+过氧化氢0μl；每孔加完试剂后立即用移液枪吹打均匀，然后加入H2O2溶液，最后用去离子水补充溶液体积至300μL，在37℃温度下反应100min，再利用酶标仪测出反应液在512nm处的吸光度，根据公式计算即得到抗坏血酸对羟自由基的抑制率S％：S％＝[(A样-A对照)-A损]/(A未损-A损)*100％A样：加入Vc的羟自由基体系；A对照：Vc的吸光值；A损：加H2O2的羟自由基体系；A未损：不加H2O2的羟自由基体系。现有利用邻菲罗啉检测抗坏血酸对羟自由基的抑制率的技术具有以下缺点：样品用量大，试剂消耗量大，废弃试剂处理量大；一次测样数目少，仅4个样，不能完成大批量筛选；灵敏性差，检测过程中存在人为误差。相对于传统方法，本专利技术技术方案具有以下优点：①灵敏性高、准确性高。传统分光光度方法由于用量大等问题，对羟自由基检测的灵敏度不够，而且分光光度计是水平光路，而酶标仪是垂直光路，垂直光路的优点是标本吸光度受液体浓缩或稀释度的影响较小，酶标仪测量时的灵敏度较高，测量的数据更为准确；②样品需求量少。如果使用传统分光光度方法进行抗羟自由基活性实验，一个浓度、单个实验就需要至少4ml的样品溶液，而在天然产物分离中，很多时候所获的活性成分质量很少，显然无法满足要求。微量检测法仅需要40-70μl的样品溶液，为天然产物活性成分抗羟基自由基氧化活性的检测提供了微量、灵敏的新方法；③迅速、简便、大批量。由于传统分光光度方法的抗羟自由基活性实验在反光光度计中进行，所以一次最多检测4个样品；同传统分光光度方法进行抗羟自由基活性实验相比，微量检测法在酶标仪中完成，一次可进行96个样品的检测工作，配合多通道移液器，更具有操作简便、快速减少失误的优点。附图说明图1为本专利技术实施例一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法流程示意图。图2为本专利技术中反应温度对·OH清除能力线性关系图；图3为本专利技术中反应时间对·OH清除能力线性关系图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1所示，本专利技术实施例提供的一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法，包括如下步骤：1)供试抗坏血酸溶液的制备：称取1.0000g抗坏血酸，定容于25mL容量瓶，浓度为：40g/L，保存于4℃的冰箱中，临用前稀释抗坏血酸溶液的浓度至5.24mg/mL；2)检测用溶液的配制：(1)制备邻菲啰啉溶液：称取0.0991g邻菲啰啉粉末，用少量纯水溶解后定容于100mL容量瓶中，浓度为：5mmol/L，临用前稀释至浓度3mmol/L；(2)制备H2O2溶液：用移液枪移取100μL浓度30％的H2O2原液，稀释300倍至浓度0.1％；(3)制备FeSO4溶液：称取0.0521g的FeSO4·7H2O固体，用含0.2mL浓硫酸的水溶解后定容于25mL容量瓶中，临用前配制且稀释至5mmol/LFeSO4溶液。(4)磷酸盐缓冲溶液：PH＝7.4，浓度1mol，购买成品，使用时去离子水稀释至0.1mol；3)邻菲啰啉微量法测定抗坏血酸对羟自由基抑制率：在96孔板依次按下表1加入的磷酸盐缓冲液(PBS)、邻菲罗啉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)供试抗坏血酸溶液的制备：称取1.0000g抗坏血酸，定容于25mL容量瓶，浓度为：40g/L，保存于4℃的冰箱中，临用前稀释抗坏血酸溶液的浓度至5.24mg/mL；2)检测用溶液的配制：(1)制备邻菲啰啉溶液：称取0.0991g邻菲啰啉粉末，用少量纯水溶解后定容于100mL容量瓶中，浓度为：5mmol/L，临用前稀释至浓度3mmol/L；(2)制备H2O2溶液：用移液枪移取100μL浓度30％的H2O2原液，稀释300倍至浓度0.1％；(3)制备FeSO4溶液：称取0.0521g的FeSO4·7H2O固体，用含0.2mL浓硫酸的水溶解后定容于25mL容量瓶中，临用前配制且稀释至5mmol/L FeSO4溶液；(4)磷酸盐缓冲溶液：PH＝7.4，浓度1mol，购买成品，使用时去离子水稀释至0.1mol；3)邻菲啰啉微量法测定抗坏血酸对羟自由基抑制率：在96孔板依次按下述各组试剂配比，加入磷酸盐缓冲液(PBS)、邻菲罗啉溶液、硫酸亚铁溶液及抗坏血酸溶液；1、样品组 PBS60μl+邻菲罗啉80μl+硫酸亚铁80μl+Vc40μl+过氧化氢40μl2、对照组 PBS60μl+邻菲罗啉0μl+硫酸亚铁0μl+Vc40μl+过氧化氢0μl3、损伤组 PBS60μl+邻菲罗啉80μl+硫酸亚铁80μl+Vc40μl+过氧化氢40μl4、未损伤组 PBS60μl+邻菲罗啉80μl+硫酸亚铁80μl+Vc40μl+过氧化氢0μl；每孔加完试剂后立即用移液枪吹打均匀，然后加入H2O2溶液，最后用去离子水补充溶液体积至300μL，在37℃温度下反应100min，再利用酶标仪测出反应液在512nm处的吸光度，根据公式计算即得到抗坏血酸对羟自由基的抑制率S％：S％＝[(A样‑A对照)‑A损]/(A未损‑A损)*100％A样：加入Vc的羟自由基体系；A对照：Vc的吸光值；A损：加H2O2的羟自由基体系；A未损：不加H2O2的羟自由基体系。...

【技术特征摘要】
1.一种微量法检测抗坏血酸对羟自由基抑制率的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)供试抗坏血酸溶液的制备：称取1.0000g抗坏血酸，定容于25mL容量瓶，浓度为：40g/L，保存于4℃的冰箱中，临用前稀释抗坏血酸溶液的浓度至5.24mg/mL；2)检测用溶液的配制：(1)制备邻菲啰啉溶液：称取0.0991g邻菲啰啉粉末，用少量纯水溶解后定容于100mL容量瓶中，浓度为：5mmol/L，临用前稀释至浓度3mmol/L；(2)制备H2O2溶液：用移液枪移取100μL浓度30％的H2O2原液，稀释300倍至浓度0.1％；(3)制备FeSO4溶液：称取0.0521g的FeSO4·7H2O固体，用含0.2mL浓硫酸的水溶解后定容于25mL容量瓶中，临用前配制且稀释至5mmol/LFeSO4溶液；(4)磷酸盐缓冲溶液：PH＝7.4，浓度1mol，购买成品，使用时去离子水稀释至0.1mol；3)邻菲啰啉微量法测定抗坏血酸对羟自由基抑制率：在96孔板依次按下...

【专利技术属性】
技术研发人员：马琳，凡明锦，林启荣，王晗，倪莹，
申请(专利权)人：宝鸡文理学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61