离体胃粘膜细胞分离方法技术

一种离体胃粘膜细胞分离方法及相应的纯化方法，其特征为：所述的分离方法依次包括粘膜细胞收集、溶液纯化稀释、物理因素分离三个步骤；其中，粘膜细胞收集步骤包括刮取胃粘膜上皮的操作；溶液纯化稀释步骤依次包括获得洁净粘膜上皮的初步清洗操作、为获得的洁净粘膜上皮碎末而进行的机械破碎操作、为获得粘膜细胞沉淀而进行的初步机械分离操作、以及为得到粘膜细胞悬液进行的纯化／稀释与离心分离交替操作，而且纯化／稀释与离心分离交替操作中采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法；物理因素分离步骤是为获得粘膜细胞清液进行的过筛操作。本发明专利技术的分离方法对胃粘膜细胞伤害最轻、且简单快捷。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物体上表皮细胞研究、培育所用的分离方法领域，具体涉及从动物的活体或尸体的胃内壁上表皮上提取并分离粘膜细胞以作进一步生理/生化研究和纯化的方法领域。
技术介绍
在动物的生命活动中，通过胃部消化食物是生命活动中一个很重要的营养环节，其中，胃上皮组织的各种粘膜细胞在此中起着重要的作用胃壁细胞产生消化食物所需的盐酸，胃主细胞产生消化蛋白质的胃蛋白酶原，表面粘液细胞和颈粘液细胞产生丰富的粘多糖类粘液，而ECL细胞则分泌组胺，G细胞分泌胃泌素，D细胞分泌生长抑素等等。这些胃细胞中，以个体最大的胃壁细胞为例，其在分离与生理/生化方面的意义最为重要，例如，消化性胃溃疡疾病中，胃壁细胞分泌的胃酸在胃溃疡病的发生与进展中起着举足轻重的作用，而胃壁细胞及其他粘膜细胞的功能调解是受到神经、体液等因素综合作用的结果，因此，如仅对胃壁细胞或其他粘膜细胞在组织、器官上作综合研究难以提供单因素作用的模型，也使研究不能继续深入。因此，实现胃壁细胞等粘膜细胞的分离及纯化，是生命科研项目中一个非常重要的环节。但是，由于胃粘膜细胞比较娇弱且多种类混居，对机械性损伤、生理/生化性损伤均很敏感，要将之完好无损地分离开来，确实有很大难度，稍微强烈的机械作用或生理/生化作用，都可能给胃粘膜细胞带来损伤甚至完全消化破坏掉胃粘膜细胞，从而影响后续的纯化或培育。目前国内、外的同行，摸索出一些胃粘膜细胞的分离方法，出版物公开的几篇为陈蕾、黄威权等的“大鼠胃壁细胞的分离及培养”一文，发表在《第四军医大学学报》2002，23(9)上，聂克、王汝俊等的“大鼠胃壁细胞的分离方法”一文，发表在《世界华人消化杂志》1999年11月号上，李晓波、钱家鸣等的“壁细胞的淘洗分离与应用”一文，发表在《胃肠病学和肝病学杂志》1996年12月号上；这些方法的指导思想都是尽可能地避免使机械或生理/生化的分离因子直接或过强地作用于胃粘膜细胞，为做到这一点，这些胃粘膜细胞的分离方法普遍做法是须将胃囊整体切除下来，扎闭贲门、幽门两端，在胃壁上再新开一个第三口，顺新开的第三口，将胃囊内翻外、外转内，扎闭新开的第三口，完成将胃浆膜面翻到内面，而粘膜面翻到外面；然后用注射器，向胃囊内注入消化液，将内含消化液的胃囊整个置入盛有含消化酶的平衡盐营养液的烧杯中，消化一定时间后，将整个的盛有胃囊及营养液的烧杯，放到磁力搅拌器上，借助磁力搅拌籽在烧杯中转动搅拌，将胃囊外面的、已被囊内的消化酶所消化松动的胃粘膜细胞机械性地搅脱下来，达到使胃粘膜细胞、包括壁细胞彼此分离的目的。上述传统的分离方法，由于要将胃囊整体切除、翻转消化提取，不能对活体状况下的胃粘膜细胞壁进行部分提取，势必限制该方法在更广泛的领域中的普及应用；取下的胃粘膜细胞泡在含消化酶的平衡盐营养液中消化1小时以上，同时借助磁力搅拌器的搅拌籽的机械搅拌力来促使被囊内消化酶消化松动的囊外细胞分散、分离下来，所以，胃粘膜细胞势必受到相当程度的生化和机械损害；此外，因为传统方法时间较长，细胞“老化”严重，细胞活力将明显减弱，使原来预期的分隔效率大打折扣。
技术实现思路
针对现有技术的上述缺点，本专利技术所要解决的技术问题是要提供一种从机械分离强度上、和从生理/生化分离强度上、时间老化上均对所分离的胃粘膜细胞伤害最轻、简单高效的离体胃粘膜细胞分离方法及其相应的研究、纯化方法。为此，本专利技术的技术解决方案之一是一种离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于所述的方法依次包括粘膜细胞收集、溶液纯化稀释、物理因素分离三个步骤；其中，所述的粘膜细胞收集步骤包括采用机械刮具在离体或活体的胃内壁上刮取胃粘膜上皮的操作；所述的溶液纯化稀释步骤依次包括将刮取下来的胃粘膜上皮投入溶液中以获得洁净粘膜上皮的初步清洗操作、在上述的清洗溶液中为获得的洁净粘膜上皮碎末而进行的机械破碎操作、从获得的洁净粘膜上皮碎末溶液中为获得粘膜细胞沉淀而进行的初步机械分离操作、以及为得到粘膜细胞悬液而对上一操作所获的粘膜细胞沉淀重复数次地进行的纯化/稀释与离心分离交替操作，而且所述的纯化/稀释与离心分离交替操作中采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法；所述的物理因素分离步骤是为获得粘膜细胞清液而对溶液纯化稀释步骤所获的粘膜细胞悬液进行的过筛操作。所述的机械刮具是化学惰性的、具有直角刃口的刮片；所述的通气兼搅拌方法是在每次离心分离前，采用其管口经过火焰倒角的玻璃吸吹管插入离心分离管底对泡在稀释纯化液中的粘膜细胞沉淀作通气兼搅拌；所述的过筛操作所采用的网筛孔径为0.05～0.50mm。所述的机械刮具是具有直角刃口的平整玻璃片；所述的溶液纯化稀释步骤中，环境温度保持在32℃±5℃，环境气氛为O2-95％，CO2-5％；相应地，所述的通气兼搅拌包括利用压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体和向离心分离管底混匀悬液以保持连续冒出圆气泡的速率吹入环境气氛的气体；所述的网筛是100目的不锈钢丝网筛。在所述的溶液纯化稀释步骤中，所述纯化/稀释与离心分离交替操作的重复次数为1～5次，在每次该操作中，所述的粘膜细胞沉淀的体积与稀释纯化液的体积之比是0.1～0.3∶5(ml/ml)，所述压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体的次数是5～10次；过筛操作前压缩空气断续吸/放离心分离管中未混匀液体的次数是25～30次。所述的溶液纯化稀释步骤中，上一操作所获的粘膜细胞沉淀在所述的稀释纯化液中被纯化/稀释的持续时间为5～10分钟；所述的离心分离转速是1000rpm，离心分离的持续时间是5分钟；最后一次纯化/稀释与离心分离操作所获的粘膜细胞悬液不作离心分离，而直接进行所述的过筛操作以得到粘膜细胞清液，来进一步作细胞生理/生化研究或培育。所述的初步机械分离操作包括采用具有经过火焰倒角的、内径为1mm的吸嘴的吸管从洁净粘膜上皮碎末溶液中吸取得到粘膜细胞粗分液的过程、以及对该粘膜细胞粗分液进行初次离心分离得到初次粘膜细胞沉淀。所述的离体胃粘膜细胞分离方法、以及溶液稀释步骤中所采用的稀释纯化液是由生理/生化平衡盐水按不同配比加入消化酶、助剂、酸碱缓冲剂、营养剂、抗生素等配伍而成的系列溶液。所述的生理/生化平衡盐水是hanks平衡盐溶液或earle’s平衡盐溶液；所述的消化酶是选自胶原酶、链蛋白酶、胰蛋白酶中一或几种；所述酸碱缓冲剂选自羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、碳酸氢钠、磷酸系列中一或几种；所述助剂选自乙二胺四乙酸系列(EDTA)、二硫苏糖(DTT)中一或几种；所述营养剂选自牛血清蛋白(BSA)、胎牛血清、葡萄糖中一或几种；所述抗菌素选自链霉素、青霉素、庆大霉素中一或几种。所述的系列溶液的pH值控制在7.4。本专利技术的技术解决方案之二是一种离体胃粘膜细胞的纯化方法，其特征在于所述的纯化方法是将所述分离方法1～9中之一得到的粘膜细胞清液作为原液，采用不连续密度梯度离心分离法或/和差速离心淘洗分离法进行进一步分离纯化，得到更高纯度的胃粘膜细胞。本专利技术的方法的粘膜细胞收集步骤尽管也要伤及动物的胃壁，但毕竟不是非要将胃囊及胃袋整体切下来收集粘膜细胞不可，即可以无需以动物的死亡代价来取得胃粘膜细胞，因此，一定条件下，能够对活体的动物包括人类的胃粘膜细胞壁作部分提取和纯化；相比于传统的需以动物的死亡代价来取得胃粘膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种离体胃粘膜细胞分离方法，其特征在于：所述的方法依次包括粘膜细胞收集、溶液纯化稀释、物理因素分离三个步骤；其中，所述的粘膜细胞收集步骤包括采用机械刮具在离体或活体的胃内壁上刮取胃粘膜上皮的操作；所述的溶液纯化稀释步骤依次包括将刮取下来的胃粘膜上皮投入溶液中以获得洁净粘膜上皮的初步清洗操作、在上述的清洗溶液中为获得的洁净粘膜上皮碎末而进行的机械破碎操作、从获得的洁净粘膜上皮碎末溶液中为获得粘膜细胞沉淀而进行的初步机械分离操作、以及为得到粘膜细胞悬液而对上一操作所获的粘膜细胞沉淀重复数次地进行的纯化／稀释与离心分离交替操作，而且所述的纯化／稀释与离心分离交替操作中采用了向离心分离管中所盛的粘膜细胞溶液进行通气兼搅拌方法；所述的物理因素分离步骤是为获得粘膜细胞清液而对溶液纯化稀释步骤所获的粘膜细胞悬液进行的过筛操作。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋于刚，孙凤蓬，
申请(专利权)人：宋于刚，孙凤蓬，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]