一种用于药用野生稻保护繁育的方法，属植物组织培养技术领域。该药用野生稻保护繁育方法包括：外植体选择、种子处理、种子灭菌处理、种子催芽处理、种子芽愈伤诱导、愈伤材料处理、愈伤诱导培养和愈伤继代培养、分化培养、一次继代分化培养、二次继代分化培养、分化增殖培养、壮苗培养、生根培养、苗的锻炼培养、苗的温室移栽及苗的田间移栽和田间秧苗管理步骤。本发明专利技术解决了药用野生稻种子愈伤诱导和分化成苗困难的问题，且诱导出愈伤率和分化率较高，经组培快繁得到的药用野生稻植株长势较好，该方法为药用野生稻及其他组培困难的稻属品种通过种子组培快繁进而分化成苗提供了有力的技术支持，也为药用野生稻的保护和利用提供了行之有效的方法。
A method for the protection and breeding of medicinal wild rice
A method for the protection and breeding of medicinal wild rice, which belongs to the technical field of plant tissue culture. Including the protection of wild rice breeding methods: explant selection, seed treatment, seed sterilization, seed germination treatment, seed bud callus induction, callus material, induce callus and callus subculture and differentiation culture, a subculture differentiation culture, the two subculture differentiation culture, proliferation culture, seedling differentiation culture, rooting, seedling cultivation, seedling transplanting exercise and seedling transplanting in greenhouse and field seedling management steps. The invention solves the seeds of wild rice callus induction and seedling differentiation problems, and induce callus and differentiation rate after micropropagation by medicinal wild rice plants were growing well, the method for medicinal wild rice and other difficult rice species by tissue culture and Micropropagation seed seedling differentiation provide strong technical support, but also provide a effective method for the protection and utilization of medicinal wild rice.
【技术实现步骤摘要】
一种用于药用野生稻保护繁育的方法
：本专利技术涉及一种药用野生稻保护繁育的方法，属于植物组织培养
技术介绍
：野生稻是栽培稻的原始祖先，其长期生长在野外经受了各种逆境胁迫的选择，遗传多样性丰富，保存有大量栽培稻不具有或已经消失了的优异基因，具有重要的学术价值和经济价值。中国有普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻。其中药用野生稻(OryzaofficinalisWall)是最具有研究价值的资源，在稻属22个种中生长势最强，是普通栽培水稻的20倍以上，具有超大穗、超宽叶片、超粗茎秆等性状，抗逆能力非常强，其基因组、基因型和栽培稻、普通野生稻的差异很大，一旦发掘利用，将会对水稻育种和生产带来突破进展。然而，由于垦荒、养殖、放牧、修建基础设施、设立旅游点以及环境污染、环境恶化等多种因素的影响，我国药用野生稻的自然群落正在迅速减少，有些分布点已绝迹或濒临灭绝，如何保护、研究、利用我国宝贵的药用野生稻资源，是我国水稻育种工作者亟待解决的问题。药用野生稻为多年生禾本科植物，由于其特殊性，种子保存不是其适合的资源保存方式，药用野生稻的种子在经过一段时间的保存后，几乎没有活力，无法通过常规栽培方法长成植株，而利用药用野生稻种子通过常规组培快繁的方法得到愈伤，进而分化成苗得到药用野生稻植株的过程也极为艰难，目前有关药用野生稻种子诱导愈伤和分化成苗的文献报道极少且均未提及药用野生稻的出愈伤率和分化率。近年来，一些学者采取稻属带节茎段扦插的方法来实现野生稻种质资源保存和复壮快繁，并取得了较好的效果。但药用野生稻长年生存在野外，经多代自然繁殖以后，常积累了大量的病毒。利用组织培养技术，能够快速去除病毒，加快药用野生稻的繁殖速度和繁殖量，缩短了药用野生稻的育种周期，可在短期内实现遗传背景一致的药用野生稻材料规模化生产，满足有些以大量遗传背景一致的药用野生稻为实验材料进行抗性基因和新种质育种研究的需要。因此，寻找一种通过药用野生稻组培快繁获得遗传背景一致的药用野生稻材料是本领域科技人员长期想探索的技术问题。本专利技术提供的一种药用野生稻保护繁育的方法，经文献检索，未见与本专利技术相同技术的公开报道。
技术实现思路
：本专利技术目的在于克服了药用野生稻成熟种子很难诱导出愈伤、分化出组培苗的棘手问题，从实践中解决和提供了一种用于药用野生稻成熟种子快速繁殖的培养方法。本专利技术的药用野生稻成熟种子保护繁育的快速繁殖培养方法，具体步骤：a.外植体选择：外植体选择当年收获的成熟种子，用纸袋装好，备用；b.种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，弃壳，剥离出完整的米粒，再用小型三角锉刀将米粒表面挫出浅凹或用细砂纸将种子的表皮磨干净并用无菌水洗4遍，用滤纸吸干水份，将处理后的米粒放入已灭菌的三角瓶中，待用；c.种子灭菌处理：将装有带凹面米粒的三角瓶置于无菌台中，用无菌水清洗种子2遍，再用体积百分比为75％酒精表面消毒1分钟，摇动三角瓶，倒掉，用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌15分钟，摇动三角瓶，倒掉，再用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌5分钟，摇动三角瓶，倒掉，用无菌水清洗6遍，无菌种子待用；d.种子催芽处理：将灭菌处理后的种子置于铺有无菌滤纸直径为50毫米的培养皿上，在培养皿中加入15mL无菌水后将其放置在温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，培养4天后种子露白，6天后种子长出小芽；e.种子芽愈伤诱导：将催芽处理后出芽的种子接入诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养；种子芽愈伤诱导培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；f.愈伤材料处理：出芽的种子在28℃人工气候箱中暗培养16天后长出愈伤，按此条件继续培养10天，待愈伤长至0.1厘米，将愈伤用无菌手术刀切下，弃掉芽和胚只留下透明紧实的愈伤；g.愈伤诱导培养和愈伤继代培养：将透明紧实的愈伤接入愈伤诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中暗培养30天后，愈伤长至0.5厘米，将其转接入愈伤继代培养基上进行继代培养，经过30天的继代培养，待其长至0.8厘米、紧实、透明、颗粒饱满的愈伤时，即可进行分化培养；愈伤诱导培养基和愈伤继代培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；h.分化培养：将上述诱导继代得到的0.8厘米紧实透明的愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养；分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA4mg/L+ZT2mg/L+NAA0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；i.一次继代分化培养：分化培养30天后，愈伤长至1厘米，此时愈伤的形态为：透明，表面微小膨松，出现细微淡绿；将愈伤中细微淡绿的部分转接到一次继代分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度4000Lux的人工气候箱中进行一次继代分化培养；一次继代分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA3mg/L+ZT2mg/L+NAA0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；j.二次继代分化培养：一次继代分化培养30天后，愈伤表面的绿色加深并出现绿色分化凸起点，将一次继代分化的绿色凸起愈伤转接到二次继代分化培养基中，放置在人工气候箱中进行二次继代分化培养，二次继代分化培养的人工气候箱条件与一次继代分化培养的相同；二次继代分化培养基为：MS基本培养基+6-BA3mg/L+ZT2mg/L+NAA0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；k.分化增殖培养：二次继代分化培养5天后，绿色分化凸起的愈伤分化成苗，此时将人工气候箱的光照强度由4000Lux降至2500Lux，进行弱光培养，其他条件不变，培养14天后，整块愈伤中的分化苗伸长，此时分化苗纤细，略显黄，愈伤组织颜色加深，将整块愈伤和分化苗接入分化增殖培养基中，放置在温度为28℃，光照强度2500Lux的人工气候箱中进行光照分化增殖培养；分化增殖培养基配方为：MS基本培养基+6-BA4mg/L+NAA0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；l.壮苗培养：分化增殖培养20天后，经过两次继代分化培养和分化增殖培养的愈伤和分化苗同时生长出少许丛苗，此时分化苗和丛生苗细长，茎纤细，茎节略大，叶片修长，叶片表面有绒毛，须根伸长，发达，已经展现出药用野生稻的外部特征；把细长分化苗和丛生苗切成独立苗，弃掉须根，接入壮苗培养基中，进行壮苗生长培养，培养条件与分化增殖培养一致；壮苗培养基配方为：MS基本培养基+TDZ2mg/L+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；m.生根培养：壮苗培养20天后，经过壮苗培养的独立苗茎秆变粗，叶片加宽，叶片表面绒毛挺立，植株颜色深绿，组培瓶中的整株单苗矮壮，将壮苗培养的独立单苗接入生根培养基中，放置在温度为28℃，光照强度3000Lux的人工气候箱中进行光照生根培养；生根培养基配方为：MS基本培养基+NAA0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖20g/L，pH＝5.8；n.苗的锻炼培养：生根培养5天后，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于药用野生稻保护繁育的方法，其特征在于该培养方法的具体步骤如下：a.外植体选择：外植体选择当年收获的成熟种子，用纸袋装好，备用；b.种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，弃壳，剥离出完整的米粒，再用小型三角锉刀将米粒表面挫出浅凹或用细砂纸将种子的表皮磨干净并用无菌水洗4遍，用滤纸吸干水份，将处理后的米粒放入已灭菌的三角瓶中，待用；c.种子灭菌处理：将装有带凹面米粒的三角瓶置于无菌台中，用无菌水清洗种子2遍，再用体积百分比为75％酒精表面消毒1分钟，摇动三角瓶，倒掉，用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌15分钟，摇动三角瓶，倒掉，再用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌5分钟，摇动三角瓶，倒掉，用无菌水清洗6遍，无菌种子待用；d.种子催芽处理：将灭菌处理后的种子置于铺有无菌滤纸直径为50毫米的培养皿上，在培养皿中加入15mL无菌水后将其放置在温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，培养4天后种子露白，6天后种子长出小芽；e.种子芽愈伤诱导：将催芽处理后出芽的种子接入诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养；种子芽愈伤诱导培养基配方为：MS基本培养基+2,4‑D 5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；f.愈伤材料处理：出芽的种子在28℃人工气候箱中暗培养16天后长出愈伤，按此条件继续培养10天，待愈伤长至0.1厘米，将愈伤用无菌手术刀切下，弃掉芽和胚只留下透明紧实的愈伤；g.愈伤诱导培养和愈伤继代培养：将透明紧实的愈伤接入愈伤诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中暗培养30天后，愈伤长至0.5厘米，将其转接入愈伤继代培养基上进行继代培养，经过30天的继代培养，待其长至0.8厘米、紧实、透明、颗粒饱满的愈伤时，即可进行分化培养；愈伤诱导培养基和愈伤继代培养基配方为：MS基本培养基+2,4‑D 5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；h.分化培养：将上述诱导继代得到的0.8厘米紧实透明的愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养；分化培养基配方为：MS基本培养基+6‑BA 4mg/L+ZT2mg/L+NAA 0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；i.一次继代分化培养：分化培养30天后，愈伤长至1厘米，此时愈伤的形态为：透明，表面微小膨松，出现细微淡绿；将愈伤中细微淡绿的部分转接到一次继代分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度4000Lux的人工气候箱中进行一次继代分化培养；一次继代分化培养基配方为：MS基本培养基+6‑BA 3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；j.二次继代分化培养：一次继代分化培养30天后，愈伤表面的绿色加深并出现绿色分化凸起点，将一次继代分化的绿色凸起愈伤转接到二次继代分化培养基中，放置在人工气候箱中进行二次继代分化培养，二次继代分化培养的人工气候箱条件与一次继代分化培养的相同；二次继代分化培养基为：MS基本培养基+6‑BA 3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；k.分化增殖培养：二次继代分化培养5天后，绿色分化凸起的愈伤分化成苗，此时将人工气候箱的光照强度由4000Lux降至2500Lux，进行弱光培养，其他条件不变，培养14天后，整块愈伤中的分化苗伸长，此时分化苗纤细，略显黄，愈伤组织颜色加深，将整块愈伤和分化苗接入分化增殖培养基中，放置在温度为28℃，光照强度2500Lux的人工气候箱中进行光照分化增殖培养；分化增殖培养基配方为：MS基本培养基+6‑BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；l.壮苗培养：分化增殖培养20天后，经过两次继代分化培养和分化增殖培养的愈伤和分化苗同时生长出少许丛苗，此时分化苗和丛生苗细长，茎纤细，茎节略大，叶片修长，叶片表面有绒毛，须根伸长，发达，已经展现出药用野生稻的外部特征；把细长分化苗和丛生苗切成独立苗，弃掉须根，接入壮苗培养基中，进行壮苗生长培养，培养条件与分化增殖培养一致；壮苗培养基配方为：MS基本培养基+TDZ 2mg/L+6‑BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；m.生根培养：壮苗培养20天后，经过壮苗培养的独立苗茎秆变粗，叶片加宽，叶片表面绒毛挺立，植株颜色深绿，组培瓶中的整株单苗矮壮，将壮苗培养的独立单苗接入生根培养基中，放置在温度为28℃，光照强度3000Lux的人工气候箱中进行光照生根培养；生根培养基配方为：MS基本培养基+NAA 0.25mg/L+植...
【技术特征摘要】
1.一种用于药用野生稻保护繁育的方法，其特征在于该培养方法的具体步骤如下：a.外植体选择：外植体选择当年收获的成熟种子，用纸袋装好，备用；b.种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，弃壳，剥离出完整的米粒，再用小型三角锉刀将米粒表面挫出浅凹或用细砂纸将种子的表皮磨干净并用无菌水洗4遍，用滤纸吸干水份，将处理后的米粒放入已灭菌的三角瓶中，待用；c.种子灭菌处理：将装有带凹面米粒的三角瓶置于无菌台中，用无菌水清洗种子2遍，再用体积百分比为75％酒精表面消毒1分钟，摇动三角瓶，倒掉，用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌15分钟，摇动三角瓶，倒掉，再用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌5分钟，摇动三角瓶，倒掉，用无菌水清洗6遍，无菌种子待用；d.种子催芽处理：将灭菌处理后的种子置于铺有无菌滤纸直径为50毫米的培养皿上，在培养皿中加入15mL无菌水后将其放置在温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，培养4天后种子露白，6天后种子长出小芽；e.种子芽愈伤诱导：将催芽处理后出芽的种子接入诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养；种子芽愈伤诱导培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；f.愈伤材料处理：出芽的种子在28℃人工气候箱中暗培养16天后长出愈伤，按此条件继续培养10天，待愈伤长至0.1厘米，将愈伤用无菌手术刀切下，弃掉芽和胚只留下透明紧实的愈伤；g.愈伤诱导培养和愈伤继代培养：将透明紧实的愈伤接入愈伤诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中暗培养30天后，愈伤长至0.5厘米，将其转接入愈伤继代培养基上进行继代培养，经过30天的继代培养，待其长至0.8厘米、紧实、透明、颗粒饱满的愈伤时，即可进行分化培养；愈伤诱导培养基和愈伤继代培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；h.分化培养：将上述诱导继代得到的0.8厘米紧实透明的愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养；分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA4mg/L+ZT2mg/L+NAA0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；i.一次继代分化培养：分化培养30天后，愈伤长至1厘米，此时愈伤的形态为：透明，表面微小膨松，出现细微淡绿；将愈伤中细微淡绿的部分转接到一次继代分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度4000Lux的人工气候箱中进行一次继代分化培养；一次继代分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA3mg/L+ZT2mg/L+NAA0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；j...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玲仙，陈越，柯学，付坚，程在全，钟巧芳，陈玲，肖素勤，张敦宇，殷富有，王波，蒋聪，蒋春苗，赵才美，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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