一种自身免疫性肝炎模型及利用该模型筛选的药物制造技术

本发明专利技术公开了一种自身免疫性肝炎模型及利用该模型筛选的药物。本发明专利技术首先建立了一种AAGL诱导的AIH‑like小鼠肝炎模型，该模型对于传统免疫抑制剂的治疗不敏感，可作为临床对传统免疫抑制治疗不敏感病人的动物模型。本发明专利技术进一步利用该模型筛选治疗自身免疫性肝炎的药物，结果表明醋酸格拉替雷能够显著地缓解该动物模型的自身免疫性肝炎症状，说明醋酸格拉替雷能够用于治疗自身免疫性肝炎。因此，本发明专利技术提供了醋酸格拉替雷的一种新用途，为自身免疫性肝炎的治疗提供了新的药物。

A model of autoimmune hepatitis and the drug screened by this model

The invention discloses a model of autoimmune hepatitis and a drug screened by the model. The invention firstly sets up a AAGL AIH like induced hepatitis model mice, the model is not sensitive to the traditional treatment of immunosuppressive agents, can be used as animal model for inhibition is not sensitive to the patient's clinical traditional immunity. The invention further uses the model to screen drugs for autoimmune hepatitis. The results show that glasgart acetate can significantly relieve the autoimmune hepatitis symptoms of the animal model, indicating that glasgart acetate can be used to treat autoimmune hepatitis. Therefore, the invention provides a new use of Grady acetate and provides a new drug for the treatment of autoimmune hepatitis.

【技术实现步骤摘要】
一种自身免疫性肝炎模型及利用该模型筛选的药物
本专利技术涉及一种非人动物模型,具体是一种自身免疫性肝炎模型的建立及利用该模型筛选到的药物醋酸格拉替雷在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中的用途。
技术介绍
自身免疫性肝炎（Autoimmunehepatitis,AIH）是由于自身免疫系统紊乱，引起病理变化以及功能紊乱，导致免疫细胞直接或间接攻击肝实质细胞，而产生自身抗体，造成肝脏损伤的炎症疾病，但是其详细的病理机理仍然不清楚。目前其治疗方案有限：免疫抑制治疗及肝脏移植。治疗药物可以分为标准治疗和选择性治疗。标准治疗为强的松龙联合或者不联合咪唑硫嘌呤，1950～1960年，发现皮质类固醇和咪唑硫嘌呤具有较好的效果，但是皮质类固醇有严重的负作用（主要是库氏综合征样变化，骨质疏松症，糖尿病，白内障，高血压，精神病等），咪唑硫嘌呤的负作用主要是血球减少、血细胞中巯基嘌呤甲基转氨酶的活性低。由于药效不明显或者药物的毒副作用导致病人无法继续用药，后期发展了选择性治疗；1970～1980年代，他克莫司和环孢霉素作为选择性免疫抑制药钙调磷酸酶抑制剂，对于皮质类固醇治疗不敏感的病人可以使用，它们的毒效副作用是高血压，肾功能缺陷，高血脂，多毛症，感染以及其它的恶性疾病；霉酚酸酯，英夫利昔，布地奈德也经常被用为选择性药物，但仍然有毒副作用。虽然以上药物可以对80%以上病人有明显的疗效，但是长期使用这些免疫抑制，即使是低剂量，其副作用非常明显，而当药物停用后，70-80%的病人会复发，且有15-20%对现有药物治疗效果不明显。当病情发展为肝脏衰竭，或者爆发性肝炎则不能进行免疫抑制治疗，必须考虑肝脏移植。如果不进行治疗，大约50%的病人会在5年内死亡。目前大约有7种研究AIH的模型，肝脏匀浆免疫法、替代抗原（ConA/α-GalCer）免疫法、抗原/TCR转基因法、负载抗原的DC细胞免疫法、利用分子相似性的病毒感染法、特定基因敲除法、AIH抗原免疫法，这些都是对免疫抑制剂敏感模型，不能反映临床上15~20%对于传统疗法不敏感的病人。因此，建立新AIH模型，对更全面地研究AIH的发病机理，开发新的疗效确切的药物非常迫切并具有重要意义。醋酸格拉替雷，英文名称为Glatirameracetate，是一种传统用于治疗多发性硬化症的多肽混合物，它由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸组成的随机聚合物，平均分子量大小约为4700~11000道尔顿，结构式为(Glu,Ala,Lys,Tyr)x·xCH3COOH。醋酸格拉替雷的合成方法已经在美国专利3849550，5800808，5981589，6048898，6054430，6342476，6362161等中进行了描述。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的小鼠自身免疫性肝炎模型，该模型可以作为对传统免疫治疗不敏感的自身免疫性肝炎病人的模型，研究疾病发生机理，并筛选药物。本专利技术的另一目的是提供经过该模型筛选获得的药物醋酸格拉替雷在制备治疗肝炎，尤其是治疗自身免疫性肝炎的药物中的新用途。实现本专利技术目的的技术方案是：在第一方面，本专利技术提供了一种小鼠自身免疫性肝炎模型的制备方法，包含如下步骤：（1）AAGL的制备：a）将茶树菇用ddH2O浸泡，浸泡液利用硫酸铵沉淀法，透析得到总蛋白；然后利用lactose-Sepharose6B的亲和层析柱得到目的蛋白AAGL，AAGL在ddH2O中透析过夜，透析液冻干（BiochemicalJournal,2003(374):321-327）；或者b）重组表达：将AAGL的编码cDNA序列克隆到表达载体，转入大肠杆菌中，进行表达，用lactose-Sepharose6B亲和纯化或者用标签亲和纯化。（ProteinandPeptideLetters.2005,12(7):705-7.）。（2）将AAGL的冻干粉末用PBS溶解，配成0.25mg/ml的浓度，用0.22μm的滤器过滤后，按照小鼠体重尾静脉注射到C57BL/6小鼠中，3小时以后可以检测到ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）有显著增加，一直到12小时后ALT和AST缓慢下降，至24小时恢复正常水平；6-9小时是检测肝炎症状的最佳时间。优选地，所述自身免疫性肝炎的症状包括：（1）对于传统免疫抑制剂的治疗不敏感，所述的治疗不敏感包括：治疗后症状没有减轻，或者症状加重；所述传统免疫抑制剂包括：强的松龙联合咪唑硫嘌呤、强的松龙不联合咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯、英夫利昔、布地奈德、他克莫司或环孢霉素中的任意一种或多种。（2）肝脏组织中Treg的比率升高，同时Treg被激活，肝脏中IL-10的表达量升高，炎性细胞在肝脏中聚集并激活；所述炎性细胞包括：T细胞、NK细胞或NKT细胞中的任意一种或多种。在本专利技术的具体实施例中对该小鼠模型的发病机理进行研究，结果发现：该模型中大量的炎性细胞（T，NK，NKT细胞）在肝脏聚集并激活。用CD4或者CD8单克隆抗体封闭小鼠后，小鼠的肝炎更加严重，后期流式和WB实验也证明，该模型中Treg被聚集并激活在小鼠肝脏。消除或者抑制Kupffer，NK和NKT细胞后，小鼠的肝炎也没有缓解，但是流式实验表明在该模型中，NK和NKT细胞都大量聚集在肝脏，并且也都被激活分泌IFN-γ，说明该模型中许多炎性细胞参与促炎作用，并且都是独立的，单独抑制某一类细胞，其它促炎细胞会有补偿作用，因此表现为肝炎没有缓解。肝脏组织qPCR结果表明，在该小鼠模型中肝脏有大量的细胞因子和趋化因子表达，这对于流式观察到的大量淋巴细胞的聚集和激活是对应的；同时，在这些细胞因子中，IL-1β，IL-6，TNF-α的表达量都有极显著的升高，说明在该模型中Kupffercells也是被激活的。IL-10的表达量也明显升高，再次说明Treg也是被激活的，所以免疫抑制剂环孢霉素CsA不能缓解该肝炎模型。在第二方面，本专利技术提供经过小鼠自身免疫性肝炎模型筛选获得的药物醋酸格拉替雷在制备治疗肝炎，尤其是治疗自身免疫性肝炎的药物中的新用途，优选地，所述的自身免疫性肝炎发病期间，肝脏组织中Treg的比率升高，同时Treg也被激活，肝脏中IL-10的表达量显著升高；大量炎性细胞在肝脏中聚集并激活，发生细胞因子风暴。在本专利技术的具体实施例中将醋酸格拉替雷处理小鼠后，肝炎模型中肝脏和脾脏的Treg比率上升，血清ALT，AST指标明显下降，说明醋酸格拉替雷能够显著地缓解该动物模型的自身免疫性肝炎的各种症状。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术建立了一种AIH-like小鼠肝炎模型，该模型对于传统免疫抑制剂的治疗不敏感。本专利技术进一步利用该模型来筛选治疗自身免疫性肝炎的药物，结果发现醋酸格拉替雷能够治疗自身免疫性肝炎。因此，本专利技术提供了醋酸格拉替雷在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中的新用途，也为这类肝炎的治疗提供了一种新的药物。附图说明图1为纯化的AAGLSDS-PAGE电泳图；图2为一种新的AIH-like小鼠肝炎模型的浓度和时间效应；其中，A图为AAGL诱导小鼠肝炎具有浓度依赖效应；B图为PBS，AAGL和ConA注射小鼠后，肝脏组织的H&E染色，发现与ConA类似，AAGL处理后，小鼠肝脏有大量坏死；C和D图为AAGL和Co本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠自身免疫性肝炎模型的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）AAGL的制备：a）天然纯化：将茶树菇用ddH2O或磷酸缓冲液浸泡，浸泡液利用硫酸铵沉淀法，透析得到总蛋白；然后利用lactose‑Sepharose 6B的亲和层析柱得到目的蛋白AAGL，AAGL在ddH2O中透析过夜，透析液冻干；或者b）重组表达：将AAGL的编码cDNA序列克隆到表达载体，转入大肠杆菌中，进行表达，用lactose‑Sepharose 6B亲和纯化或者用标签亲和纯化；（2）将步骤1制得的AAGL的冻干粉末用PBS溶解，配成0.25 mg/ml的浓度，用0.22μm的滤器过滤后，按照小鼠体重尾静脉注射到C57BL/6小鼠中，3小时以后可以检测到ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）有显著增加，一直到12小时后ALT和AST缓慢下降，至24小时恢复正常水平；6‑9小时是检测肝炎症状的最佳时间；所述自身免疫性肝炎的症状包括：（1）对于传统免疫抑制剂的治疗不敏感，所述的治疗不敏感包括：治疗后症状没有减轻，或者症状加重；所述传统免疫抑制剂包括：强的松龙联合咪唑硫嘌呤、强的松龙不联合咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯、英夫利昔、布地奈德、他克莫司或环孢霉素中的任意一种或多种；（2）肝脏组织中Treg的比率升高，同时Treg被激活，肝脏中IL‑10的表达量升高，炎性细胞在肝脏中聚集并激活；所述炎性细胞包括：T细胞、NK细胞或NKT细胞中的任意一种或多种。...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠自身免疫性肝炎模型的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）AAGL的制备：a）天然纯化：将茶树菇用ddH2O或磷酸缓冲液浸泡，浸泡液利用硫酸铵沉淀法，透析得到总蛋白；然后利用lactose-Sepharose6B的亲和层析柱得到目的蛋白AAGL，AAGL在ddH2O中透析过夜，透析液冻干；或者b）重组表达：将AAGL的编码cDNA序列克隆到表达载体，转入大肠杆菌中，进行表达，用lactose-Sepharose6B亲和纯化或者用标签亲和纯化；（2）将步骤1制得的AAGL的冻干粉末用PBS溶解，配成0.25mg/ml的浓度，用0.22μm的滤器过滤后，按照小鼠体重尾静脉注射到C57BL/6小鼠中，3小时以后可以检测到ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）有显著增加，一直到12小时后ALT和AST缓慢下降，至24小时恢复正常水平；6-9小时是...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙慧，余文卉，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42