稀土元素盐在制备用于治疗糠尿病的胰岛β-细胞中的用途制造技术

本发明专利技术涉及稀土元素盐在生物领域中的用途，尤其是稀土元素盐在体内或体外诱导分化胰腺干／前体细胞为治疗糖尿病的胰岛β－细胞中的用途。本发明专利技术还涉及制备胰岛β－细胞的方法，其包括将稀土元素盐与胰腺干／前体细胞接触。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及稀土元素盐在生物领域中的用途，尤其是稀土元素盐在体内或体外诱导分化胰腺干/前体细胞为治疗糖尿病的胰岛β-细胞中的用途。本专利技术还涉及制备胰岛β-细胞的方法，其包括将稀土元素盐与胰腺干/前体细胞接触。
技术介绍
稀土元素离子的离子半径与钙离子的相似，同属硬酸类金属，其配位化学行为及配合物的几何构型等相似，能在许多生物化学过程中取代钙的位置，成为钙的拮抗剂。取代后有些过程中仍保持钙的性质，但也会产生与钙完全不同的一些生物化学性质，从而有‘超级钙’之称。稀土元素进入体内将与氨基酸广泛作用，已发现稀土氨基酸配合物具有杀菌效应。80年代后，有作者利用顺磁性稀土离子作为探针研究肽在溶液中的构象和肽与金属离子的配位方式，这些特定的结构信息对于分析蛋白质和酶等生物大分子的结构与功能关系，了解稀土离子及其它金属离子(如Ca2+)与生物大分子的作用特点都具有重要的参考价值。另外，稀土元素还可以与蛋白质，核酸等生物大分子结合，改变其构象和功能。有些稀土化合物已开发为治病的药物。1906年一种商品名为Ceriform的外用杀菌药就已在欧洲市场上出售，其主要化学成分为硫酸铈钾。草酸铈在上世纪中叶已被作为止吐药物用于临床。1982年英国Martindale药典28版将硝酸铈作为治疗烧伤药物收载。Fox和Monafo等发现2.2％的硝酸铈(Ce(NO3)3·6H2O)和1％磺胺嘧啶银(AgSD)的复方悬浊液，对烧伤有很好的疗效。稀土化合物在抗凝血方面具有重要医用价值。临床上称为Trombodym的-磺基异烟酸钕既是一低毒性和抗凝性高的稀土化合物抗凝剂。钕和混合稀土的磺基水杨酸化合物具有非常显著的解热降温作用，比同计量的常用解热阵痛药阿司匹林好。通过兔和猴的实验表明，氯化镧可预防由膳食引起的主动脉和冠状动脉硬化。另外，钆的鳌合物(Gd(DTPA))是用得最广泛的核磁共振成像造影剂。甲苯磺丁脲钆配合物(Gd-D860)是合成的降糖药甲苯磺丁脲(D860)的稀土配合物，发现Gd-D860具有更强的降糖作用。但是糖尿病的降糖药物治疗是有局限性的，只是治标措施，不能从根本上阻断糖尿病患者的渐进性多脏器病变的发生。目前，胰岛移植被认为是一种有前景的糖尿病治疗方法。胰岛移植可以为患者提供胰岛素分泌细胞，有效地控制血糖代谢，减少和改善糖尿病的并发症，进而达到根治糖尿病的目的。但目前的分离技术，进行一例移植至少需要1～2个供体胰腺，供体不足是胰岛移植发展的最大障碍。理论上，胰岛干细胞可在体外大量扩增并可经诱导分化为胰岛细胞，成为解决这一问题的希望所在。有关胰腺干/前体细胞的研究是目前全世界糖尿病研究领域的热点，人们希望能够通过人工方法将胰腺干/前体细胞诱导为成熟胰岛β-细胞，从而为从根本上治愈糖尿病提供最佳方法。但至今还没有发现一个好的诱导分化胰腺干/前体细胞为成熟胰岛β-细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供诱导分化胰腺干/前体细胞的胰岛β-细胞。本专利技术人经研究现已发现稀土元素盐，可使人的胚胎胰腺组织来源的Nestin阳性的胰腺干/前体细胞聚集成球，成球后的细胞经诱导剂的诱导后可诱导分化为成熟胰岛β-细胞，它们不但胞内有高表达的胰岛素和C-肽(C-肽为人胰岛素原降解为成熟胰岛素时释放的小分子多肽，C-肽的测定是成熟的人胰岛β-细胞更特异的测定方法，因为它不受细胞培养基中的胎牛血清的干扰。)，而且对高糖刺激敏感，可在高糖刺激下释放胰岛素和C-肽。将这些体外培养的，经稀土元素盐，诱导成熟的细胞移植给糖尿病模型裸鼠，可明显降低糖尿病模型裸鼠的血糖水平。且在裸鼠的血清中检测到人胰岛素和C-肽，表明这些移植的细胞可以在动物体内发挥胰岛β-细胞的作用。将这些体外培养的人的胚胎胰腺组织来源的Nestin阳性的胰腺干/前体细胞直接移植给糖尿病模型裸鼠，同时给该裸鼠注射稀土元素盐，可明显降低糖尿病模型裸鼠的血糖水平，且在裸鼠的血清中检测到人胰岛素和C-肽，同时在裸鼠的细胞移植部位用免疫组化的方法检测到能表达人胰岛素的细胞，表明这些移植的细胞在稀土元素盐作用下可以在动物体内分化为胰岛β-细胞。本专利技术的第一方面涉及稀土元素盐在制备用于治疗糖尿病的胰岛β-细胞中用途。本专利技术的另一个方面是提供治疗糖尿病的方法，其包括将经稀土元素盐诱导分化的胰腺干/前体细胞给予糖尿病患者。本专利技术提供另一种治疗糖尿病的方法，其包括给予糖尿病患者未分化的胰腺干/前体细胞和稀土元素盐。上述两种方法也可以同时应用。本专利技术还涉及制备胰岛β-细胞的方法，其包括将胰腺干/前体细胞与稀土元素盐接触。根据本专利技术，稀土元素包括但不限于镧(La)，铈(Ce)，镨(Pr)，钕(Nd)，钐(Sm)，铕(Eu)，钆(Gd)，铽(Tb)，镝(Dy)，钬(Ho)，铒(Er)，铥(Tm)，镱(Yb)，镥(Lu)，钇(Y)，钪(Sc)。本专利技术中优选的稀土元素为镧(La)，钆(Gd)，镥(Lu)。本专利技术中稀土元素盐是指常温下在水中可溶的稀土元素盐。稀土元素盐为稀土元素与酸接触后形成的稀土元素盐。所述的酸可以是有机酸或无机酸。其中有机酸包括但不限于枸橼酸或乙酸，无机酸包括但不限于硫酸，盐酸，氢溴酸，氢氟酸或氢碘酸。进一步讲，稀土元素盐优选其氯化物，溴化物，碘化物，更优选稀土元素氯化物，如氯化钆。本专利技术中糖尿病是指对胰岛素不足或无胰岛素产生的糖尿病，如I型和II型糖尿病。具体实施例方式实施例1氯化钆诱导分化人胚胎胰腺干/前体细胞为胰岛β-细胞及其细胞移植对糖尿病模型鼠的治疗人胚胎胰腺干/前体细胞的体外培养取米索引产的20周龄的人胚胎的新鲜胰腺组织，置4℃的D-Hank’s液中，解剖显微镜下剥除胚胎胰腺组织的被膜，保存胰腺组织实质，将其剪碎至大约1mm3的小组织块，加入4倍体积的5.5mg/ml的胶原酶V(SIGMA)37℃孵育10分钟，用4倍体积的4℃的D-Hank’s终止酶反应，50g离心3分钟，弃上清，收集细胞团沉淀，再用同样的离心条件，用3ml D-Hank’s液洗涤细胞团2次，之后，将这些细胞团接种于直径100mm的含有DMEM(低糖)/F12培养基的平皿中，置37℃，5％二氧化碳孵箱中，24小时后，小心收集仍然悬浮的细胞团，弃去已贴壁的细胞(多为污染的血细胞)。然后将这些细胞团接种于一25cm2含有10％胎牛血清，20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF的DMEM(低糖)/F12培养基的培养瓶中，置于37℃，5％二氧化碳孵箱。数天后，显微镜下可观察到有单层细胞从接种的细胞团中爬出，待单层细胞汇合后，进行传代。在这样的培养条件下，传代4次，将获得接近100％Nestin阳性的细胞群体。对这一细胞群体进行鉴定发现，该细胞表达Nestin蛋白，且RT-PCR结果证实其胞内含有ABCG2和OCT4等干细胞标识基因的mRNA。稀土元素盐对人胚胎胰腺干/前体细胞的体外分化诱导取长满细胞培养瓶的Nestin阳性的细胞，吸去培养液，用D-Hank’s液洗一次。加入0.25％胰蛋白酶约1ml，室温消化1-2分钟，显微镜下观察，当看到细胞开始变圆，但还没有离壁时，将胰蛋白酶液体吸去，加入适量培养液，吹打细胞使其离壁，离心收集细胞。用含有0.01mM，0.1mM或1mM氯化钆的培养液悬浮细胞，然后将本文档来自技高网...

【技术保护点】
稀土元素盐在制备用于治疗糖尿病的胰岛β－细胞中用途。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李凌松，李丽英，
申请(专利权)人：李凌松，李丽英，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]