本发明专利技术涉及植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］的高效分泌表达和应用，克隆基因ｈｒｐＮ↓［Ｅｃｃｓ］的宿主菌是白菜软腐菌变种ＣＳＤＳ００１菌株，该细菌在分类上属于胡萝卜软腐欧文氏杆菌，核甘酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１，Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］蛋白的氨基酸序列特征（Ｎ→Ｃ）为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２。克隆ｈｒｐＮ↓［Ｅｃｃｓ］基因，构建融合分泌表达载体ｐＭＡＬ（ｐ２）－ｈｒｐＮ↓［Ｅｃｃｓ］，转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）和ＤＨ５ α菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，结果使可溶性的融合分泌表达蛋白ＭＢＰ－Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］占细菌周质总蛋白的６６％以上，实现了Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］蛋白的高效分泌表达，为Ｈａｒｐｉｎ类蛋白的快速纯化、检测、制备和应用打下了良好基础。ｈｒｐＮ↓［Ｅｃｃｓ］基因编码的蛋白激发子，能广泛诱导植物的广谱抗病性、驱虫性和抗逆性，并显著促进植物的生长发育和提高产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，特别是涉及一种胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜软腐菌变种CSDS001菌株hrpNEccs基因以及此基因通过生物技术方法提高植物多功能活性和广谱抗性并改良植物品质的应用。
技术介绍
微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物。按作用机理不同又可分为传统微生物蛋白农药和新型微生物蛋白农药。传统微生物蛋白农药主要是来自苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药主要是蛋白激发子类物质，它与传统微生物蛋白农药最大的区别在于其不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因的表达，并促进植物生长发育。目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白农药主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受关注、最有应用前景的是Harpin类蛋白激发子。Harpin蛋白主要是由欧文氏杆菌属(Erwinia)细菌产生的一类能激发植物过敏反应的蛋白质(30-40kda)，可诱导植物体内一系列基因的表达，激活植物自身的生长系统和防卫系统，从而使植物能抵御多种病害的侵染和逆境的胁迫，并获得促进生长发育和提高增产的效果。1992年，美国康乃尔大学的韦忠民等首先从梨火疫欧文氏杆菌(E.amylovora)中克隆出这类过敏蛋白基因，并首次提出Harpin蛋白诱导植物的过敏反应可能与其抗病性作用有关，由此推动了新型微生物蛋白农药研究的兴起。经过约10年的努力，以此为背景的美国Eden生物科技公司成功开发和研制出具有广谱抗病防虫功能的新型微生物蛋白农药Messenger，该产品以其对大田作物和经济作物抗病增产方面良好的效果以及对绿色无公害农业卓越的贡献，曾两度获美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。现代分子植物病理学揭示，植物病原细菌既有其致病性，也有诱导植物产生抗病性和促进生长的能力，而决定这种能力的基因是植物病原细菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因决定着植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitive response onnon-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity on host plants)。HR是植物一种局部的、快速的细胞编程死亡形式，是植物主动抗性的结果，其抗性作用不仅表现在对病原细菌侵染扩展的限制，而且能进一步诱导植物体内产生类似免疫机制的系统获得性抗性反应。继韦忠民等(Wei et al.1992)成功克隆和表达hrpNEa基因之后，近10多年来人们又相继从E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到编码Harpin类蛋白的基因，并成功表达了这些蛋白，如HarpinEcc，36kda，MukherjeeA.1997；HarpinEch，36kda，Bauer D.W.1995；HarpinPss，34.7kda，Preston G.1995；HarpinPsg，35.3kda，Preston G.1995；HarpinPst，36.5kda，Preston G.1995；HarpinXoo，15.3kda，闻伟刚2001；HarpinXooc，15.6kda，闻伟刚2001等。最近的研究表明，Harpin类蛋白可能在植物的信号通路中起着重要作用。研究人员用Harpin处理拟南芥，发现拟南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn离子通道以及各种氧化酶被激活，这些氧化酶包括ACC合成酶、抗坏血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侣前体等等。现在通常认为，植物细胞壁中广泛存在Harpin蛋白的受体，即Harpin结合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通过与这些受体蛋白HrBP结合激活植物中的多条信号通路。Harpin蛋白虽然来源于病原菌，但作为一类非特异性的激发蛋白因子，却能引起非寄主植物发生过敏反应，并诱导其抗病性、驱虫性和抗逆性的增加，以及促进生长、提高产量等。为达此目的，获取HarpinEccs的高效分泌表达就具有明显的现实意义。
技术实现思路
植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子HarpinEccs的高效分泌表达克隆hrpNEccs基因，其特征在于，构建融合分泌表达载体pMAL(p2)-hrpNEccs，转化大肠杆菌JM109(DE3)和DH5α菌株，IPTG诱导表达，使可溶性的融合分泌表达蛋白MBP-HarpinEccs占细菌周质总蛋白的66％以上，实现HarpinEccs蛋白的高效分泌表达。具体实施例方式现将有关内容表述如下1、白菜软腐菌染色体DNA的制备从LB平板上挑取生长状态良好的菌落，于37℃下在LB液体培养基中振荡培养12小时，离心收集菌体，按分子克隆实验手册(Sambrook J等，1989)的方法提取、纯化细菌染色体DNA。2、hrpNEccs基因的PCR扩增与纯化据GeneBank中已报道的胡萝卜软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的hrpNEcc基因序列，设计一对PCR扩增引物，即P15′-TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG-3′和P25′-TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACCC-3′。其中P1为HarpinEcc蛋白的N端编码序列，并在起始密码子ATG前引入了新的限制酶切位点BamH I(G/GATCC)，P2为HarpinEcc蛋白的C端编码序列的互补序列，引入了新的限制酶切位点HindIII(A/AGCTT)。用上面分离的白菜软腐菌的染色体DNA作模板，按如下扩增参数进行PCR反应先95℃预变性5min，然后94℃/2min 1个循环；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24个循环；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min 1个循环。经PCR扩增后，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳鉴定，得到了长度约1.1kb左右的DNA扩增带。扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。3、hrpNEccs基因的克隆与测序纯化后的PCR目的产物用限制酶BamH I和HindIII双酶切，同时对克隆载体pET28a(+)也进行BamH I和HindIII双酶切，酶切产物分别用琼脂糖凝胶电泳回收，在T4DNA连接酶作用下12℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109(DE3)，挑选阳性克隆，经鉴定后进行全自动序列分析。结果表明，hrpNEccs基因共计1071个核苷酸，序列如SEQ ID.No1。与相关基因序列进行比较分析表明，hrpNEccs基因富含甘氨酸密码子，缺少半胱氨酸密码子；与来自胡萝卜软腐欧氏杆菌褐腐致病菌(Erwinia carotovorasubsp.carot本文档来自技高网...
【技术保护点】
植物多功能活性和广谱抗性细胞信号因子Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］的高效分泌表达，其特征在于，构建融合分泌表达载体ｐＭＡＬ（ｐ２）－ｈｒｐＮ↓［Ｅｃｃｓ］，转化大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）和ＤＨ５α菌株，ＩＰＴＧ诱导表达，使可溶性的融合分泌表达蛋白ＭＢＰ－Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］占细菌周质总蛋白的６６％以上，实现Ｈａｒｐｉｎ↓［Ｅｃｃｓ］蛋白的高效分泌表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴伯骥，汤承，崔亚亚，
申请(专利权)人：成都派润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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