蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的一级结构制造技术

蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的一级结构属于生物技术领域，涉及到重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒去整合素突变体蛋白的氨基酸残基序列与相应的核苷酸序列，及其抑制人血小板聚集的预防和治疗血栓作用，特别涉及到蛇源去整合素突变体益康蛋白的氨基酸残基序列及其相应的核苷酸序列。其由７３个氨基酸残基组成的小分子量的蛋白质，含１２个半胱氨酸残基，形成６个二硫键。本发明专利技术所达到的有益效果是，具有抑制人血小板聚集的作用，而没有抑制血管新生的作用。更有利于用于防治人血栓的形成，可作为抗血小板聚集的药物，进一步开发。主要适用于抗人血小板聚集疗法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
涉及重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒去整合素突变体蛋白的氨基酸残基序列与相应的核苷酸序列，及其抑制血小板聚集的抗血栓作用，特别涉及蛇源去整合素突变体益康蛋白的氨基酸残基序列及其相应的核苷酸序列。
技术介绍
血小板聚集性高是血液高凝的指标。抑制人血小板聚集可有效地预防和治疗因血小板聚集引起的血栓症，用于预防和治疗心、脑缺血性疾病和外周血栓栓塞性疾病。人们一直认为某些蛇毒中含有抑制血小板聚集的因子，但一直未能得到有效成分。目前国内外防治血小板聚集引起血栓的药物主要有四类1.抑制血小板代谢的药物，如阿司匹林、利多格雷、依前列醇等；2.阻碍ADP引起血小板活化的药物，如噻氯匹定；3.凝血酶抑制剂，如阿加曲斑、水蛭素；4.血小板膜糖蛋白受体阻断剂，如阿伯西马、SC-54684(均处于临床观察阶段)。我们研究证明，基因重组大连白眉蝮蛇去整合素突变体抗血小板聚集药益康的作用机制属于第4类，可与血小板细胞膜糖蛋白GPIIaIIIb结合，抑制血小板与纤维蛋白原、vW因子等结合，从而抑制血小板之间的聚集。我们从旅顺白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffi brevicaudus)的毒腺中克隆出一种可以编码小分子量蛋白质(艾丁比特)的cDNA，并在大肠杆菌和酵母菌中成功地表达。这方面的成果已经申请了专利。艾丁比特含有模体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的黏附因子整合蛋白αvβ3结合，抑制其活性；也能与血小板膜上糖蛋白GPIIaIIIb结合，抑制血小板聚集。我们在文献上发现一种来自Sistrurusmiliarius barbouri(dusky pigmy rattlesnake)毒液中的去整合素Barbourin含有KGD模体，而不含有RGD模体。Barbourin仅有抑制血小板聚集的作用，而无抑制血管新生的作用。但是，Barbourin与艾丁比特的氨基酸序列同源性仅为79％，即存在15个氨基酸的差异。我们将艾丁比特进行定点突变修饰，将其功能模体RGD人工突变成KGD。从而去除了艾丁比特所特有的抗血管新生作用，而仅具有抗血小板聚集的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是给出比重组旅顺白眉蝮蛇蛇毒艾丁比特更为优化的小分子蛋白质益康的氨基酸残基顺序，使其仅存在抑制血小板聚集的作用，而去除其抑制血管新生的作用，进而用于预防和治疗血液黏度过高、防治心、脑血管和人体其他部位血栓形成的蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的一级结构。本专利技术的技术解决方案是采用基因工程的技术手段，对用于抗肿瘤疗法的重组白眉蝮艾丁比特分子进行修饰，以去除其抑实体肿瘤组织内血管生成和仅保留其抗血小板聚集的作用。蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的一级结构是由73个氨基酸残基组成的小分子量的蛋白质，含51位氨基酸残基为赖氨酸，含有赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模体，含12个半胱氨酸残基和六个二硫键；这六个二硫键的位置分别是Cys6-Cys15、Cys8-Cys16、Cys21-Cys35、Cys29-Cys59、Cys34-Cys38、Cys47-Cys66；蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的核苷酸序列含222个碱基对，其中第51个密码子，即第151～153位核苷酸，是编码赖氨酸(Lysine，K)的密码子；此密码子是AAG或AAA；编码益康的核苷酸序列为1 GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGTGCTGTGA51 TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT101 GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA151 AAG(A)GGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC201 CAGAAATCCC TTCCATGCCT AG。第51位为赖氨酸，与第52和53位共同形成KGD模体；蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的氨基酸序列如下1 EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIA51 GDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA其中，第51位氨基酸是赖氨酸。是在基因工程中所产生的含有益康氨基酸序列的融合蛋白或多肽。在基因工程中所形成的与益康上述的氨基酸序列相对应的核苷酸序列，含简并密码子，包括存在于载体上的可编码益康氨基酸序列的核苷酸序列。蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的一级结构和可编码益康的氨基酸序列，由此蛋白质在预防和治疗中的作用是通过抑制人血小板聚集来达到抗血栓的目的。本专利技术所达到的有益效果是，益康与野生型相比，第51位氨基酸由精氨酸(arginine，Arg，R)突变成赖氨酸(Lysine，Lys，K)。具有与重组旅顺白眉蝮蛇艾丁比特同等的抑制人血小板聚集的作用，而没有抑制血管新生的作用。更有利于用于防治人血栓的形成，可作为抗血小板聚集的药物，进一步开发。具体实施例方式用于人血栓预防和治疗用的益康的克隆，包括定点突变，均采用分子生物学的手段进行。益康的核苷酸序列含222个碱基对，此核苷酸序列为1 GAGGCCGGAG AAGAATGTGA CTGTGGCTCT CCTGGAAATC CGAGCTGTGA51 TGCTGCAACC TGTAAACTGA GACAAGGAGC ACAGTGTGCA GAAGGACTGT101 GTTGTGACCA GTGCAGATTT ATGAAAAAAG GAACAGTATG CCGGATAGCA151 AAG(A)GGTGATG ACATGGATGA TTACTGCAAT GGCATATCTG CTGGCTGTCC201 CAGAAATCCC TTCCATGCCT AG蛋白质益康由73个氨基酸组成，其氨基酸顺序如下EAGEECDCGS PGNPCCDAAT CKLRQGAQCA EGLCCDQCRF MKKGTVCRIAKGDDMDDYCN GISAGCPRNP FHA以本实验室保存的含有野生型基因克隆载体pPET23b-Ad为模板，点突变的步骤是1.设计引物首先根据Simple T质粒图谱设计包含有Hind III与Nde I酶切位点在内的上、下游引物，并根据突变位点设计突变引物，使需要的突变序列包含在引物的序列之中。引物P15’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’引物P25’-GTCATCACCCTTTGCTATCCGGC-3’引物P35’-ATAGCAAAGGGTGATGACATGG-3’引物P45’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’2.PCR法定点突变从大肠杆菌JM109中提取质粒Simple T-Adinbitor，并以此为模板，分别以P1/P2、P3/P4为引物进行PCR扩增，扩增产物分别命名为Insert DNA I、InsertDNA II；PCR反应体系I10×Pyrobest Buffer 5μldNTP Mixture4μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的一级结构，其特征在于，由７３个氨基酸残基组成，含５１位氨基酸残基为赖氨酸，含有赖氨酸－甘氨酸－天冬氨酸模体，含１２个半胱氨酸残基和六个二硫键；这六个二硫键的位置分别是：Ｃｙｓ６－Ｃｙｓ１５、Ｃｙｓ８－Ｃｙｓ１６、Ｃｙｓ２１－Ｃｙｓ３５、Ｃｙｓ２９－Ｃｙｓ５９、Ｃｙｓ３４－Ｃｙｓ３８、Ｃｙｓ４７－Ｃｙｓ６６；蛇源去整合素突变体抗人血小板聚集药益康蛋白的核苷酸序列含２２２个碱基对，其中第５１个密码子，即第１５１～１５３位核苷酸，是编码赖氨酸（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）的密码子；此密码子是ＡＡＧ或ＡＡＡ；编码益康的核苷酸序列为：１ＧＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡ５１ＴＧＣＴＧ ＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴ１０１ＧＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＡＴＡＧＣＡ １５１ＡＡＧ（Ａ）ＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣ２０１ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＣＴＡＧ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝昌，
申请(专利权)人：赵宝昌，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]