白眉蝮蛇去整合素的定点突变体ｃＤＮＡ序列，其特征是：将白眉蝮蛇去整合素ｃＤＮＡ序列中Ａ１４５、Ｔ１４６、Ｇ１４８突变成Ｃ１４５、Ｃ１４６和Ａ１４８，得ｃＤＮＡ含２１９个碱基对，核苷酸序列为： ＧＡＧＧＣＣＧＧＡＧ ＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡ ＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴ ＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣ ＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡ ５０ ＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣ ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡ ＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣ ＡＣＡＧＴＧＴＧＣＡ ＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴ １００ ＧＴＴＧＴＧＡＣＣＡ ＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴ ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧ ＧＡＡＣＡＧＴＡＴＧ ＣＣＧＧＣＣＡＡＣＡ １５０ ＡＧＧＧＧＴＧＡＴＧ ＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡ ＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴ ＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧ ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣ ２００ ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣ ＴＴＣＣＡＴＧＣＣ ２１９。
【技术实现步骤摘要】
白眉蝮蛇去整合素定点突变体c頂A的克隆、表达及其蛋白质制法与应用
-本专利技术属于生物
，特别涉及到白眉蝮蛇去整合素。
技术介绍
抑制恶性肿瘤血管生成是抑制肿瘤生长和肿瘤转移的关键步骤。肿瘤在1腿3以上时，其营养来源不能单靠周围体液的渗透，必需依赖血管的供应， 否则肿瘤将退化。如果用药物抑制肿瘤的血管生成，则肿瘤便不再生长，并 进一步发生凋亡，不能对机体造成危害。抗肿瘤血管生成治疗有诸多优点，主要是①肿瘤发生时，血管形成己被启动，故具有较高的特异性；②血管内 皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用，剂量小、疗效高、不良反应小； ③内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。国内外虽有一些抑制恶性 实体肿瘤血管生成的研究，但均不成熟。目前国内仅有内皮抑素问世。内皮 抑素的作用机制是通过抑制内皮细胞的增殖。中国专利CN 1 48708〗公丌了一种 白眉蝮蛇的毒腺中克隆出具有抗肿瘤血管生成的去整合素，此蛋白质含有模 体RGD，可以与血管内皮细胞膜上的粘附因子整合蛋白ocv(33结合，抑制其活性， 但也抑制血小板的聚集。目前韩国Yonsei大学生物产品研究中心生物化学系 研究的Saxatilin、我国台湾学者从Calloselasma rhodostoma提取纯化(不 是基因重组.)出的rhodostomin均具有抗肿瘤血管生成和抗血小板聚集的双重 作用。美国学者也曾经从蛇毒中提取出一种小分子量的蛋白质，称为 albolabi'in，仅研究其对血小板聚集的抑制作用，而且不是用分子克隆的方 法，是直接从蛇毒中提取的。抗血小板聚集作用可以引起出血倾向，是蝮蛇 去整合素用于抗肿瘤血管生成时的副作用，此副作用对于人体影响较大，需 设法去除其抗血小板聚集作用，使之专一具有抗肿瘤血管生成作用，增加此蛋白质作为药物治疗的安全性，但目前的蛋白质难以实现。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足问题，提供一种白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA克隆，以及由其表达的蛋白质，此蛋白质仅具有抗血管生成作用 而无抗血小板聚集作用；另外涉及蛋白质的制法，方法简单易操作，蛋白质 应用效果较^土(本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA序列，将白眉蝮蛇去整合素cDNA序列中A145、 T146、 G148突变 成C145、 C146和A148，得cDNA含219个碱基对，核苷酸序列为GAGGCCGGAG TGCTGCAACC GTTGTGACCA AGGGGTGATG CAGAAATCCCAAGAATGTGA TGTAAACTGA GTGCAGATTT ACATGGATGA TTCCATGCCCTGTGGCTCT GACAAGGAGC ATGAAAAAAG TTACTGCAATCCTGGAAATC ACAGTGTGCA GAACAGTATG GGCATATCTGCGTGCTGTGA 50 GAAGGACTGT 100 CCGGCCAACA 150 CTGGCTGTCC 200 219所述白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质由73个氨 基酸组成，其中1le49和Ala50被Pro49和Thr50所取代，氨基酸顺序如下 Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys Asp15 10 15Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gin Gly Ala Gin Cys Ala Glu Gly Leu Cys20 25 30Cys Asp Gin Cys Ar'g Phe Met Lys Lys Gly Thr Val Cys Ar'g Pro Thr Arg 35 40 45 50Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly lie Ser Ala Gly Cys Pro Arg55 60 65Asn Pro Phe His Ala 70白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质的制备将白眉蝮蛇去整合素cDNA的A145、 T146、 G148突变成C145、 C146和A148,将 带有定点突变的cDNA分别构建于质粒pET23b和pPIC9K，将质粒转化入微 生物，得到其编码的蛋白质。白眉蝮蛇去整合素的定点突变体cDNA表达的编码蛋白质的制备，具体步 骤为第一步制备含有白眉蝮蛇野生型去整合素cDNA的重组质粒pET23b-disa. 将活白眉蝮蛇断头处死，分离毒腺，迅速打碎，提取总RNA;b. 反应液中加入RNA PCR缓冲液、MgCl2、脱氧单核苷酸混合物、核糖 核酸酶抑制剂、随机9聚物、样品RNA，采用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 2. 1 进行反转录PCR反应；c. 以反转录反应得到的cDNA为模板进行PCR反应反应混合物中含有 PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸混合物、MgCl2、 Taq酶和引物，引物为PI: 5， -TTATGCATATGGAGGCCGGAGAAGAATG-3， P2: 5-TTATGAAGCTTGGCATGGAAGGGATTTC-3'd. PCR扩增产物克隆入载体pET23b:将yVc/e I和历7 c/III双酶切片段 构建入质粒pPET23b的多克隆位点中，并在大肠杆菌DH5oc中扩增；第二步对野生型去整合素进行定点突变，获得带有突变点的cDNA片段， 并构建于载体pET23b中a. 设计引起点突变的引物P3: 5' -AGTATGCCGGCCAACAAGGGGTGATG-3' P4: 5， -ACCCCTTGTTGGCCGGCATACTGTTC-3，b. 以T7启动子/引物P4，引物P3/T7终止子为引物分别进行PCR扩增， 得到片段长度分别约270bp和170bp的两个片段，T7启动子5， -TAATACGACTCACTATA-3， T7终止子5， -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，c. 以两个PCR产物为模板，以T7启动子/T7终止子为引物进行PCR扩 增，得到的产物约420bp;d.将420bp片段和载体pET23b质粒分别进行/fefel/历/7oin双酶切，琼 脂糖凝胶电泳回收相应片段，再用连接酶连接，得到含有定点突变目的基因 的质粒pET23b-mutant;第三步将突变体构建于毕赤酵母表达载体pPIC9K中a. 设计引物以获取含有定点突变的目的基因片段，设计引物 P5: 5， -CGGAATTCGAGGCCGGAGAAGAATGTGA-3，P6: 5， -TTGCGGCCGCGGCATGGAAGGGATTTCTGG-3'以上述得到的pET23b-mutant为模板，利用引物P5/P6进行PCR扩增， 反应混合液中含有PCR缓冲液、脱氧核苷二磷酸混合液、Taq DNA多聚酶， PCR产物为约220bp;b. 分别对PCR扩增的约220bp片段和载体pPIC9K进行fcoR I/淑I 双酶切，将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用连接酶进行连接，得到 含有目的基因突变体的酵母表达质粒pP工C9K-mutant。第四歩载有目的基因突变体的质粒向微生物的转化(1)本文档来自技高网...
【技术保护点】
白眉蝮蛇去整合素的定点突变体ｃＤＮＡ序列，其特征是：将白眉蝮蛇去整合素ｃＤＮＡ序列中Ａ１４５、Ｔ１４６、Ｇ１４８突变成Ｃ１４５、Ｃ１４６和Ａ１４８，得ｃＤＮＡ含２１９个碱基对，核苷酸序列为：ＧＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧＡ５０ＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴ１００ＧＴＴＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＡＣＡ１５０ＡＧＧＧＧＴＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣ２００ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＣ２１９。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝昌，
申请(专利权)人：赵宝昌，
类型：发明
国别省市：91
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