人组织蛋白酶G的DNA适体制造技术

本发明专利技术致力于组织蛋白酶Ｇ的非肽抑制剂的鉴定，其中所述的抑制剂具有高水平选择性并且能够有效地用于治疗和预防炎症发生和前凝血剂不良状况。本发明专利技术的抑制组织蛋白酶Ｇ的适体由具有至少６０个核苷酸的链长度并且基本上没有有效的碱基配对的线性ＤＮＡ或多核苷酸序列组成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
组织蛋白酶G是通常发现于嗜中性粒细胞和单核细胞嗜天青颗粒的丝氨酸蛋白酶。与弹性蛋白酶和蛋白酶3一起属于胰凝乳蛋白酶家族，并且水解细胞外基质蛋白质如弹性蛋白、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白，导致动物广泛的肺组织损伤。组织蛋白酶G还在血液凝固中起作用，事实上它参与了白血球启动的血凝固的另一个途径，并且通过激活凝血因子X和V而水解并潜在调节凝血酶受体以及体外(in vitro)激活血小板。它还能够将血管紧张素I转变成血管紧张素II，其中在分子其它处只发生较少水解。已经表明组织蛋白酶G能够杀死细菌和真菌，但是该特性与其活性无关，事实上其水解后产生的肽具有直接抗菌特性。它还能使坏死组织恶化并且因此与几种炎性疾病如肺气肿、支气管炎、囊性纤维化和银屑病相关。组织蛋白酶G的酶活性通过两类蛋白质蛋白酶抑制剂调节所谓的“典型”抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂。前者是相对较小的蛋白质(29-190个氨基酸)并且是紧密结合的可逆抑制剂；其中有Mucus蛋白酶抑制剂(MPI)、水蛭蛋白酶抑制剂c和抑蛋白酶肽。丝氨酸蛋白酶抑制剂是较大的蛋白质(400-450个残基)，由于在组织蛋白酶G的催化部位和丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应位点环域之间形成不可水解的酰基键，所以丝氨酸蛋白酶抑制剂与它们的关联蛋白质形成不可逆的复合物。在丝氨酸蛋白酶抑制剂中，1-抗胰凝乳蛋白酶是最重要的因为它们能够结合和抑制其它胰凝乳蛋白酶所以该家族抑制剂不是选择性的。而且，它们的体内(in vivo)稳定性和分布受其肽的性质的影响。从包含1，2，5-噻二唑烷-3-酮1，1-二氧化物(1，2，5-thiadiazolidin-3-one1，1dioxide)或者1，3-二氮杂环丁烷-2，4二酮的肽模拟物支架发现了几种合成抑制剂，并且它们中的一些(特别是具有芳族侧链的那些)表现出对组织蛋白酶G的相当特异的活性。然而，它们与酶形成了不可逆的酰基化合物。最近，发现全长的和水解的染色体DNA都能体外和体内结合和抑制组织蛋白酶G。一个30bp的DNA片段在生理条件下与组织蛋白酶G紧密结合，并且对人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的亲和性与对蛋白酶3的亲和性相比降低一个等级，这与弹性蛋白酶的阳离子特性降低相一致。具体而言，EP-775745公开了具有大约40个核苷酸(并且在任何情况下均低于55个核苷酸)的链长度并且包含G对重复单位的抑制组织蛋白酶G的寡核苷酸适体，它对于治疗和预防炎症发生和前凝血剂不良状况是有用的。专利技术描述本研究主要致力于组织蛋白酶G的非肽抑制剂的鉴定，其中所述的抑制剂具有高水平的选择性并且因此能够更有效地用于治疗和预防上述疾病并且也可用于治疗和预防遗传病、退化性疾病、DNA损伤、瘤形成和/或皮肤病。像抗体一样，DNA分子也能依靠它们的序列呈现出多种三维结构。它们中的一些与靶标的结合有关。在本研究中，我们采用叫作SELEX(指数富集配体系统进化)的方法选择和鉴定了称作适体并表现出对组织蛋白酶G高亲和性的ssDNA或RNA分子。适体技术结合了在寡核苷酸随机库中产生巨大结构多样性的能力和扩增所选择序列的聚合酶链式反应(PCR)的能力。该技术涉及筛选寡核苷酸的大的随机序列库，并且基于它们能够呈现出大量的四级结构的事实，在这些大量的四级结构当中一些四级结构会拥有针对靶分子的目的结合或催化活性。虽然抑制作用不是选择过程所需要的，但是在许多情况下这些配体直接抑制靶蛋白质的生物学功能。在这些情况下，配体的抑制性功能推测可能是由于它们的结合部位与蛋白质的功能区重叠所致。我们研究的结果导致阐明了一个具有相当高水平选择性的抑制组织蛋白酶G的新类适体。本专利技术的新的抑制组织蛋白酶G的适体是单链或双链线形DNA或多核苷酸序列，其特征为具有至少60个(优选70个)核苷酸的链长度并且基本上没有分子间和/或分子内碱基配对。根据本专利技术的最佳实施方案，DNA序列具有70-120个核苷酸、优选70-110个核苷酸、甚至更加优选80-100个核苷酸的链长度。虽然本专利技术的序列可以是单链或者双链的，但单链序列是优选的。本专利技术的序列还可以优选地表征为具有大约25-50％、优选35-45％的鸟嘌呤摩尔含量和/或具有大约1.0-2.0、优选1.2-1.8的AG/TC摩尔比(为了本专利技术的目的，AG意思是指序列中A和G核苷酸的总数，而TC意思是指序列中T和C核苷酸的总数)。本专利技术的优选实施方案是●(GT)n或(AC)n寡聚物(oligopolymer)，其中n为35-60，优选40-50；●(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物(omopolymer)，其中n为70-120，优选80-100。在本专利技术的条件内，措辞“基本上没有分子间和/或分子内碱基配对”意思是指在严格和非严格条件下DNA或多核苷酸序列的分子间和/或分子内碱基配对没有达到高于20％、优选高于10％、甚至更加优选高于5％的程度。此种结果是它们的结构的直接结果，因为如下事实实际上阻止了任何种类的杂交●具有1.0-2.0的AG/TC摩尔比；或●为(GT)n或(AC)n寡聚物，其中n大于30；或●为(T)n或(G)n或(A)n或(C)n或(肌苷)n单一多聚物，其中n大于60。根据下面的讨论很明显本专利技术的适体确实选择性地并有效地抑制组织蛋白酶G，并且因此它们可以用于制造治疗和预防炎症发生、前凝血剂不良状况、遗传病、退化性疾病、DNA损伤、瘤形成和/或皮肤病的药物，因此这代表了是本专利技术的目标。本专利技术的进一步目标是包含本专利技术抑制组织蛋白酶G的适体和通常的赋形剂和/或佐剂的药物组合物。本专利技术的其它目标是选自序列表中所报道(即选自SEQ ID NO1至SEQ ID NO18)的抑制组织蛋白酶G的适体。实施例实验部分材料组织蛋白酶G购自Europa Bioproducts或Calbiochem。所有的寡核苷酸从Eurogentec Bel SA(比利时)得到并在使用前用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。一些已经通过PAGE纯化的寡核苷酸从Gibco BRLCustom Primers得到。Taq聚合酶购自Pharmacia Amersham Biotech，而dNTP钠盐购自Boehringer Mannheim。T4多核苷酸激酶、连接酶和限制酶购自Gibco Life Technologies。使用Qiagen试剂盒进行质粒小量制备纯化并且使用T7序列(Pharmacia Amersham Biotech)和dATP(NenLife Sciences)进行测序。ssDNA文库合成的随机库是96个碱基长度的，并且分子的中间部分是随机区，随机区的两侧是用于扩增、克隆和测序的两个恒定区；其序列为5’CGTACGGAATTCGCTAGC(N)60GGATCCGAGCTCCACGTG-3’。下划线的序列分别指EcoRI和BamHI的限制位点。通过使用引物II-up(其序列为5’-CGTACGGAATTCGCTAGC-3’)和引物III-Down(5’Biot-CACGTCGAGCTCGGATCC-3’，其中在5’端进行生物素化以便能够被链霉亲和素柱结合以得到ssDNA)的PCR对库进行扩增。选择方法将开始的随机库用32p进行放射性标记、在高温下变性并在本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制组织蛋白酶Ｇ的适体，其由具有至少６０个核苷酸的链长度和经受低于２０％的程度的分子间和／或分子内碱基配对的线性ＤＮＡ或多核苷酸序列组成，其中所述序列表征为：　　　　.具有１．０－２．０的ＡＧ／ＴＣ摩尔比；或　　　　.是（ＧＴ）↓［ｎ］或（ＡＣ）↓［ｎ］寡聚物，其中ｎ大于３０；或　　　　.是（Ｔ）↓［ｎ］或（Ｇ）↓［ｎ］或（Ａ）↓［ｎ］或（Ｃ）↓［ｎ］或（肌苷）↓［ｎ］单一多聚物，其中ｎ大于６０。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M帕伦博，B加托，R佩斯卡多尔，R波尔塔，LI费罗，
申请(专利权)人：真蒂奥姆有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]