本发明专利技术从近源物种肌动蛋白的基因的ＣＤＳ序列的保守区设计的兼并引物，从斑节对虾的性腺中提取总ＲＮＡ，并用ＰＣＲ法扩增，克隆到斑节对虾热休克蛋白９０基因的表达序列。斑节对虾热休克蛋白９０基因的分离，对于研究软体动物体内的热休克蛋白９０对环境中的污染因素的应激反应，从而探讨能否将该分子作为一种生物学指标具有重要的理论意义和实践意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学中基因克隆领域，尤其涉及斑节对虾热休克蛋白90的基因的核苷酸及氨基酸序列。
技术介绍
热休克蛋白90(Hsp90)是一类特异的分子伴侣，在进化中具有高度保守性。早期认为它可协助变性蛋白从高温或其它应激环境中复性，并可促进已产生突变的蛋白质降解。近年来的研究显示Hsp90具有广泛的生理功能，它参与调节多种蛋白质在非应激条件下的生物活性，其中包括调节DNA的复制、基因转录、亚细胞结构的蛋白质转移、细胞信号转导、免疫应答、以及生长、发育、凋亡等。Hsp90还与Ras信号途径中许多信号分子的折叠与组装密切相关，主要是Hsp90的结合与解离，介导了这些分子在非活性形式与活性形式间的转化或在一定条件下，从Hsp90等与之形成的复合物中释放，才能转位至胞膜，行使激酶的活性功能。Hsp90还具有使突变蛋白质具备类似野生型构象活性的作用。因此，研究这类进化上非常保守的蛋白的基因表达调控机制和相关的信号转导是非常重要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种斑节对虾热休克蛋白90基因序列，它通过以近源物种热休克蛋白的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到斑节对虾热休克蛋白90基因的全表达序列。上述目的是通过以下技术方案来实现的解剖斑节对虾取出性腺，提取总RNA，使之与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录，合成第一链cDNA。从GenBank中下载近源物种(如人、牛、斑马鱼、爪蛙等)热休克蛋白90同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为680bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成得到以下引物序列 X90F5’-ATgATTggACAgTTYggTgT-3’X90R5’-TACAgYTTgATITTgTTCTT-3’。以合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。本专利技术另外再根据已得到的第一链cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。在3′端的快速扩增中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由基因引物和接头引物进行PCR反应，扩增片段大小约为1500bp。所述的基因引物和接头引物序列为基因引物5’TCGGGGACTTCGCATACATC 3’接头引物5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。经3′端的快速扩增后的序列在其5′端进行快速扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和oligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和oligodG进行第二次PCR扩增。所述引物序列为oligo-dG5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’基因外侧引物5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’基因内侧引物5’GCCGACAAGGTGACCGTAGT 3’。经末端快速扩增技术进行PCR所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接得到目的基因。斑节对虾热休克蛋白90基因的分离，对于研究软体动物体内的热休克蛋白90对环境中的污染因素的应激反应，从而探讨能否将该分子作为一种生物学指标具有重要的理论意义和实践意义。而且该基因对性腺发育具有促进的作用，因此可以通过对基因的克隆获得纯化的蛋白，来进一步检测该基因是否影响斑节对虾的性腺发育。附图说明图1是本专利技术在取温度升高前后体内的不同组织器官中的表达；No stimulated环境温度未改变为28℃；stimulated环境温度提高为38℃；RTC未加入模板时PCR反应的结果；liver代表肝脏；ovary代表卵巢；muscle肌肉；brain脑；stomach胃；heart心脏；Hsp90热休克蛋白90基因。具体实施例方式下面通过以下具体实施方式对本专利技术作进一步阐述，但是本专利技术的内容完全不局限于此。1.总RNA的提取取鲜活健康斑节对虾(体重约300g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，解剖虾体取出性腺约100mg，放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。2.cDNA第一链的合成取斑节对虾总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，RibonucleaseInhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存备用。3.兼并引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、牛、斑马鱼、爪蛙等)Hsp90同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为680bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。引物序列X90F5’-ATgATTggACAgTTYggTgT-3’ X90R5’-TACAgYTTgATITTgTTCTT-3’。4.斑节对虾热休克蛋白90基因cDNA全序列的克隆以近源物种Hsp90基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为680bp。4.1第一链cDNA用兼并引物进行PCR扩增以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为10x PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为1个循环，94℃变性5min；35个循环94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经兼并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。4.2第一链cDNA的快速扩增技术进行PCR扩增根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification ofcDNA ends，RACE)对目的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种斑节对虾热休克蛋白９０基因，其特征在于：它的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：江世贵，邱丽华，周发林，张汉华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。