用于阈值分析物校准及使用阈值分析物校准进行定量的系统、设备和方法技术方案

本文提供了用于定性和定量检测生物标本中的分析物的确定性筛选技术。

Quantitative systems, equipment and methods for threshold analyte calibration and the use of threshold analyte calibration

This article provides a deterministic screening technique for qualitative and quantitative detection of analytes in biological specimens.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于阈值分析物校准及使用阈值分析物校准进行定量的系统、设备和方法相关申请本申请要求2015年3月16日提交的美国临时申请No.62/133,717和2015年8月30日提交的美国临时申请No.62/211,855的优先权，每份美国临时申请均以引用方式并入本文。
本专利技术整体涉及液相色谱和质谱方法，特别是对质谱分析的基质效应的归一化很有用的液相色谱和质谱方法。
技术介绍
目前，通过使用竞争性结合技术或免疫结合技术的免疫测定法来执行生物标本(例如尿液)中的分析物筛选(例如药物筛选)。免疫测定法的选择性取决于分析物上的表位与测定法中采用的试剂抗体的免疫反应性。众所周知，具有相似表位的分析物类别诸如阿片类、苯二氮卓类或苯丙胺类可在筛选免疫测定法中交叉反应。因此，免疫测定法对于特异性分析物的检测不具有选择性，但可以检测该类别内反应性不同的分析物。此外，在任何内源性或外源性化学物质被表位结合位点识别并结合到表位结合位点的情况下，而且在内源性化学物质和外源性化学物质因与抗体非特异性结合而引起的其他结合的情况下，可能发生免疫测定法交叉反应。使用含有阈值浓度的表位相似类别分析物之一的生物标本，对筛选免疫测定法进行校准。因此，免疫测定方法可能无法对分析物进行确定性鉴定。所以，需要进一步测试以进行确定性鉴定。免疫测定法仅提供分析物或分析物类别的推定性鉴定，并被分类为推定性测试而不是确定性测试。鉴于与免疫测定法相关的缺陷、持续担忧化学试剂和生物试剂对公众健康的影响以及对鉴定抵御疾病的新候选药物的关注越来越多，需要确定性高通量分析物筛选技术(例如药物筛选)。
技术实现思路
本文提供了用于检测生物标本中的分析物的非推定性(即确定性)筛选技术。技术包括例如在用于选择性药物和代谢物检测的色谱(诸如液相色谱-质谱技术)分离中使用阈值分析物校准。这些技术相比基于免疫测定法的常规方法具有许多优点。例如，与免疫测定法相比，本文所述的TAC测定法代表了在生物标本的筛选中检测和鉴定分析物的确定性测试。此外，免疫测定法可能对存在于生物标本中的任何内源性或外源性试剂呈阳性，即非选择性。例如，如果试剂仅仅因为表位相似性或非特异性结合而结合到抗体，则免疫测定法可能不能够将这些事件与特异性结合事件区分开，从而导致假阳性结果。然而，由于TAC测定法在分析中使用液相色谱-质谱技术，所以允许对分析物进行选择性检测和鉴定。本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其允许在单轮分析筛选中进行多分析物检测和鉴定。参见例如图4。通过免疫测定法进行推定性筛选，需要对每种分析物类别进行多次测定。本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其仅需要可获得的纯化分析物来用作参考分析物。换句话讲，本文所述的TAC测定法可快速适应于新出现的分析物(例如设计药物)的筛选。相比之下，免疫测定法筛选需要抗体和其他免疫测定试剂的商业开发，这对新出现的分析物可能不适用。本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其允许所分析的每个标本的阈值准确度。相比之下，免疫测定法仅用该分析物类别的单个成员进行校准。与该分析物类别的其他成员不同的反应性改变了该分析物类别的成员的阈值检测浓度。本文所述的TAC测定法的另一个优点是，其代表定性和定量这两种测定的确定性测试。就免疫测定法而言，一旦获得推定性结果，当前就使用同位素稀释技术作为第二次测试。通过同位素稀释技术实现的分析物准确定量(在生物标本中所存在的阈值浓度和整个分析范围浓度两者处)需要针对每种分析物的同位素标准品(例如氘化标准品)的可用性。需要针对每种分析物的同位素标准品，以补偿可能在每个正被测试的生物样品中可变地发生的基质效应。参见例如图1和图2。这种方法的问题是同位素标准品并不适用于所有药物和代谢物，特别是新出现的策划药。至少出于这个原因，同位素稀释不易适用于筛选大量生物标本中的多分析物。然而，所述的TAC方法不受同位素标准品的可用性的限制。这是因为所公开的方法通过例如以下方式来补偿基质效应：加入以与纯生物样品中的任何分析物相同的方式来与生物基质相互作用的加标参考分析物。参见例如图3。本专利技术方法通过至少提供以下方面来解决与基于免疫测定法的常规方法相关的问题：在生物标本筛选(定性和定量这两者)中检测和鉴定分析物的确定性测试、在单轮分析筛选中的多分析物检测和鉴定、仅需要可获得的纯化分析物来用作参考分析物的方法、以及所分析的每个标本的阈值准确度。此外。在寻找与基于免疫测定法的常规方法相关的问题的解决方案时，针对本文所述的TAC定量方法意外地发现，参考分析物的浓度比在本文公开的TAC筛选和检测技术的示例性实施方案中使用的阈值浓度大许多倍，这引起TAC比率和浓度之间的关系线性化。参见例如图15。所得的TAC比率和浓度之间的线性关系允许在单个测定法中对多种分析物进行定性和定量这两种测定。本文还提供了用于按照本文所述的方法计算分析物的阈值比率和校准定量关系的装置。附图说明图1示出了使用具有相同分析物浓度的三个尿液样品时基质效应对离子面积计数的影响。图2示出了使用具有不同分析物浓度的三个尿液样品时基质效应对离子面积计数的影响。图3示出了使用本文所述方法通过在阈值浓度的参考分析物的加标(S)之前和之后分析样品而实现的基质效应的归一化。图4示出了根据本文所述方法得出的TAC校准比率的尿液间再现性。图5表示按照本文所述方法进行的TAC分析的定性筛选应用。图6示出了按照本文所述方法进行的对案例标本的TAC筛选。图7示出了通过如本文所述的TAC技术进行的多分析物校准的示例性实施方案。图8示出了通过本文所述方法测试的分析物的TAC比率。图9表示根据本文所述方法的孔内样品制备。图10表示根据本文所述方法的在水解情况下的快速孔内样品制备。图11表示根据本文所述方法的高通量滤板制备。图12示出了根据本文所述方法的高于和低于阈值质量控制数据的测定法准确度。图13示出了根据本文所述方法的高于和低于阈值质量控制数据的测定法精度。图14表示根据本文所述方法的确认测试与TAC筛选的比较。图15示出了根据本文所述方法的TAC定量原理。图16示出了根据本文所述方法的TAC定量的校准性能。图17示出了根据本文所述方法的TAC定量的校准精度。图18示出了根据本文所述方法的TAC定量的质量控制精度。图19示出了根据本文所述方法的TAC定量的偏差图。具体实施方式阈值分析物校准(“TAC”)是本文所述的分析技术或方法，其采用液相色谱-质谱技术，并允许准确和选择性地筛选、检测、鉴定和定量生物标本类型(例如尿液、口腔液、血液、毛发、指/趾甲和其他体液或组织)中的单种或多种分析物(例如药物、药物代谢物或其他化学试剂)。TAC利用阈值浓度标准来明确检测和鉴定分析物和/或确定TAC比率和分析物浓度之间的关系以进行定量。当用作筛选和检测技术(“TACS”)时，本文的TAC方法包括确定如本文所述的浓度阈值，以明确鉴定生物样品中的分析物。可以通过测定含有阈值浓度的分析物的生物标本来执行TACS方法中的校准。参见例如图4至图9。在一个方面，在任选的标本预分析处理或清理之后，筛选和检测(“TACS”)测定方法包括在添加和不添加参考分析物制剂的情况下制备和分析生物标本。对生物标本进行两次分析，一次没有添加参考分析物(纯物质)，一次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测生物标本中的分析物的方法，包括：分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及计算以下两者之间的比率：(i)所述第一结果和(ii)所述第二结果与所述第一结果之间的差值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.16 US 62/133,717;2015.08.30 US 62/211,8551.一种用于检测生物标本中的分析物的方法，包括：分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及计算以下两者之间的比率：(i)所述第一结果和(ii)所述第二结果与所述第一结果之间的差值。2.根据权利要求1所述的方法，还包括将所述比率与校准的阈值比率进行比较。3.根据权利要求2所述的方法，还包括基于所述比较来确定阈值分析物结果。4.根据权利要求2所述的方法，其中用于计算所述校准的阈值比率的步骤包括：分析生物标本的已知样品以获得第一校准结果；分析所述已知样品和在所述限定浓度下的所述参考分析物的组合以获得第二校准结果；以及将所述校准的阈值比率计算为以下两者之间的比率：(i)所述第一校准结果和(ii)所述第二校准结果与所述第一校准结果之间的差值。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度是所述分析物的阈值浓度。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述参考分析物的所述限定浓度在所述分析物的阈值浓度的约10％至所述分析物的阈值浓度的约750％的范围内。7.一种用于定量生物标本中的分析物的方法，包括：分析第一样品以获得第一结果，所述第一样品包括生物标本的第一部分；分析第二样品以获得第二结果，所述第二样品包括所述生物标本的一部分和在限定浓度下的参考分析物；以及计算以下两者之间的比率：(i)所述第一结果和(ii)所述第二结果与所述第一结果之间的差值；将所述比率与校准的定量关系进行比较；以及基于所述校准的定量关系来确定所述生物样品中的分析物的量。8.根据权利要求7所述的方法，其中用于计算所述校准的定量关系的步骤包括：分析生物标本的多个已知样品以获得多个第一校准结果，所述多个已知样品各自包含不同浓度的已知分析物；分析与在所述限定浓度下的所述参考分析物结合的所述多个已知样品中的每个以获得多个第二校准结果；以及将所述校准的定量关系计算为如下的线性回归：(a)以下两者之间的多个比率：(i)所述多个第一校准结果中的每个和(ii)所述第二校准结果中的每个与所述第一校准结果中的每个之间的对应差值，以及(b)所述已知样品中的所述已知分析物的对应不同浓度。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个已知样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：TG罗萨诺，M伍德，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US