适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒标准物质制造技术

本发明专利技术公开了一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，所述质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。该质粒DNA标准物质具有均匀性强，稳定性高的优点，同时解决了H7N9禽流感病毒实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证H7N9禽流感病毒实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为H7N9禽流感病毒实时荧光PCR方法检测提供质量控制。

Plasmid standard substance for real-time quantitative PCR detection of H7N9 avian influenza virus

The invention discloses a plasmid DNA standard material for H7N9 avian influenza virus by real-time PCR detection, the plasmid DNA standard contains substances detection sequence and the nucleotide sequence of the detection sequence as shown in the sequence list SEQ ID NO.1. The nucleotide sequence of the plasmid DNA standard material as shown in the sequence list SEQ ID NO.2. The plasmid DNA standard substances with strong uniformity, the advantages of high stability, and solves the problem of standard real-time PCR H7N9 avian influenza virus detection in the lack of methods to ensure the H7N9 avian influenza virus by real-time fluorescent PCR detection results are comparable, for the detection of H7N9 avian influenza virus real time fluorescent PCR method to provide quality control.

【技术实现步骤摘要】
适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒标准物质
本专利技术涉及一种生物工程
的质粒分子，具体涉及一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质及其构建方法、定量方法和应用。
技术介绍
H7N9禽流感病毒(avianinfluenzavirus，AIV)首先于2013年3月在我国上海、安徽发现3例，经国家卫生和计划生育委员会确认通报为全球首次发现的感染人的新型禽流感病毒株。随后在我国上海、安徽、江苏、浙江、北京、河南、山东、江西、福建和台湾等地区均出现散发的确诊病例。H7N9病毒感染者常出现严重的肺炎和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，甚至多器官功能障碍，病死率高。目前确诊的人数已经达到200多例，其中死亡超过60人。以现有病例数和死亡数字计算，H7N9的病死率达到20％至30％。人感染H7N9禽流感病例的出现受到了世界许多国家以及世界卫生组织(WHO)的关注。因此，H7N9禽流感病毒检测方法及抗病毒药物的研究是当前各国科学家和医药工作者研究的一个关注的重点。当前针对H7N9禽流感等动物传染病的诊断方法主要有病原学方法、血清学方法和分子生物学方法。病原学诊断方法准确但诊断时间较长，达不到快速检测的需求，同时要求被检测样品有较好的新鲜度；血清学诊断方法的特异性和准确度存在一定的局限性；实时荧光反转录PCR方法(real-timereverse-transcriptionPCR,real-timeRT-PCR)是分子生物学检测方法之一，直接检测病原体RNA，具有快速、特异性强且不受样品新鲜度限制的优点，且较常规PCR灵敏度更高、少污染、操作更便捷、反应更快速，可以为疾病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间，因此已经成为H7N9禽流感病毒检测的重要方法。目前已有较多文献报道使用实时荧光RT-PCR方法检测H7N9病毒，也有相应的试剂盒研制成功并投放市场。然而在实际的实时荧光RT-PCR方法检测过程中，RNA抽提失败、反转录效率低、PCR体系中存在抑制剂等因素容易造成假阴性结果，因此有必要研究具有明确量值溯源性的标准物质，形成完善的参考系统，开展试验室间质评，提高检测水平。目前针对H7N9禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法，仍然没有有证标准物质(CertifiedReferenceMaterial,CRM)，各检测单位在检测时常采用病毒阳性样本、提取的病毒RNA、非感染性体外转录RNA、自行研制的质粒DNA分子或试剂盒自带的阳性标准品作为质控品，稳定性差、存在安全隐患、阳性样品难以获取且缺乏统一的定值方法，造成各实验室之间的检测结果差异大，缺乏可比性、有效性和可靠性。目前针对H7N9禽流感病毒，WHO采用由英国国家生物标准与检定所(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl，NIBSC)研制的一种重组禽流感毒株标准品。这类标准品接近于禽流感病毒，但是存在溯源性限制，价格昂贵，数量较少，并且由于其是病毒，稳定性差，存在一定风险，对运输条件要求较高，较难运输。因此这类标准品不能完全满足各国禽流感病毒临床检验实验室质量控制的需求，也不能满足H7N9检测试剂方法标准化、性能评价的需求，急需研制新型H7N9禽流感病毒检测标准物质。质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。质粒DNA标准物质的优点主要是可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限量稳定的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高，同一个质粒分子可以同时包含多个外源目的基因，经济又高效。但是目前质粒DNA标准物质尤其是有证标准物质还是很少，这也是全世界生物计量领域研究的热点，如美国的国家标准技术研究院(NIST)、英国政府化学家实验室(LGC)和欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院(IRMM)等研究机构都投入了很大科研力量进行相关标准物质的研发，成果主要集中于转基因检测领域质粒DNA分子标准物质，但是针对病毒检测用的质粒DNA标准物质还是空白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有的重组禽流感毒株标准品价格昂贵、数量少、不能满足禽流感病毒临床检验实验室质量控制的需求，也不能满足H7N9检测试剂方法标准化、性能评价的需求的问题，提供了一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒标准物质及其构建方法、定量方法和应用。本专利技术的技术方案之一为：一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，该质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。本专利技术中，所述的检测序列由H7N9禽流感病毒的H7基因、N9基因以及M基因和人的RnaseP基因的核苷酸序列组成，其中，H7基因和N9基因作为H7N9禽流感病毒的靶基因，M基因和RnaseP基因作为内参基因。本专利技术中，较佳地，所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。其中，所述检测序列为所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列中的第2260位至第7238位。本专利技术的技术方案之二为：一种利用上述质粒DNA标准物质的定量方法，其包括以下步骤：①提取上述的质粒DNA标准物质；②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。本专利技术中，较佳地，步骤所述③高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测的条件如下：冷却气16L/min；辅助气1.8L/min；载气1.05L/min；透镜电压2200v；点火功率1000w；工作功率1300w；雾化室、雾化器为PFA材质；进样锥、取样锥为铂金材质；矩管为蓝宝石材质；和/或，Z点为3。本专利技术中，定量所述质粒标准分子的方法为本领域常规的方法，较佳地为紫外分光光度法或高分辨电感耦合等离子体质谱法(HR-ICP-MS)。其中，所述紫外分光光度法为本领域常规的紫外分光光度法，较佳地包括以下步骤：①提取上述的质粒DNA标准物质；②将紫外分光光度计校正为零点；③取适量DNA(根据仪器的需要)至比色杯中(nanodrop直接点在检测区域)，记录仪器读数。若可直接读出DNA浓度则直接记录；若不可，则记录样品在260nm和280nm的光密度，DNA样品的浓度为OD260×核酸稀释倍数×50，浓度单位为ng/μL。其中，所述HR-ICP-MS为本领域常规的HR-ICP-MS，较佳地包括以下步骤：①提取上述的质粒DNA标准物质；②根据质粒标准分子的碱基组成和序列长度，分别计算各质粒标准分子的磷元素的含量；③配制梯度浓度的磷标准溶液，并用此标准溶液作出HR-ICP-MS的标准曲线；④HR-ICP-MS检测质粒标准分子，并根据步骤③所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，其特征在于，所述质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种适用于H7N9禽流感病毒实时荧光定量PCR检测的质粒DNA标准物质，其特征在于，所述质粒DNA标准物质包含检测序列，所述检测序列的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的质粒DNA标准物质，其特征在于，所述质粒DNA标准物质的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。3.一种利用如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质的定量方法，其特征在于，其包括以下步骤：①提取如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质；②根据步骤①所得的质粒标准分子的碱基组成和序列长度，计算质粒标准分子中的磷元素的含量；③配制梯度浓度的磷标准溶液，并作出高分辨电感耦合等离子体发射质谱的标准曲线；④高分辨电感耦合等离子体发射质谱检测，并根据步骤③所得的标准曲线得出质粒标准分子溶液的磷含量；⑤根据步骤④所得的质粒标准分子溶液的磷含量和步骤②所得的质粒标准分子中的磷元素的含量，计算出质粒标准分子的浓度。4.一种定量如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物质的方法，其特征在于，所述方法紫外分光光度法或高分辨电感耦合等离子体质谱法。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述紫外分光光度法包括以下步骤：①提取如权利要求1或2所述的质粒DNA标准物...

【专利技术属性】
技术研发人员：许丽，刘刚，梁文，李妍，李兰英，闻艳丽，
申请(专利权)人：上海市计量测试技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31