一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列制造技术

本发明专利技术涉及一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列、所述右侧翼序列的应用、引物对、PCR试剂盒以及引物和PCR试剂盒的使用方法。其中，本发明专利技术所述右侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，其能够特异性地指示第3号染色体第43998179位核苷酸处插入pCHAL1的T‑DNA片段的转基因大豆。本发明专利技术首次测序公布了转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列，建立了转基因大豆WH8055特异性定性PCR检测方法，该方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的市场前景。

The right wing sequence of an exogenous insertion vector of a transgenic soybean WH8055 transformation event

The invention relates to a right wing sequence of a transgenic soybean WH8055 transformation event, an external insertion vector, the application of the right wing sequence, primer pairs, PCR kit, primers and PCR kit. Among them, the right wing sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4 shows, transgenic soybean T DNA fragment to specifically indicate 43998179th chromosome third nucleotide insertion pCHAL1. The first sequencing of the invention released the right wing sequence of transgenic soybean WH8055 transformation event, and established a specific qualitative PCR detection method of transgenic soybean WH8055. The method is sensitive, accurate, simple and reliable, and has broad market prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列
本专利技术涉及转基因大豆领域，具体而言，涉及一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列。
技术介绍
大豆是世界上主要的油料作物。2015年全球转基因作物的种植面积高达1.797亿公顷，其中大豆种植面积为0.916亿公顷，占总面积的51％[1]。中国不仅是农业生产大国，更是农业消费大国。自1996年以来，中国已成为大豆净进口国。随着国内需求不断地增加，转基因大豆进口量也在逐年增大。仅在2015年，中国转基因大豆进口量高达8169万吨，同比增长14.4％[2]。对转基因大豆生物安全问题进行科学研究和评价是对转基因大豆进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础，而转基因检测技术是生物安全评价的关键技术之一[3]，对于转基因植株的身份验证具有重大意义，并有助于对外源基因的表达机制和外源基因在受体基因组中产生的影响进行研究，从而有助对于转基因植株的生物安全性做出评估[4]。HAL1基因是酿酒酵母中与耐盐相关的基因，该基因的过量表达可以提高酵母对NaCl的胁迫，而敲除调该基因，则大大降低酵母的耐盐性。目前，已经有一些HAL1转基因植物，但尚未研究获得HAL1转基因大豆，更缺少能够有效对HAL1转基因大豆进行检测的方法。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列，所述右侧翼序列能够特异性地指示第3号染色体上第43998179位核苷酸处插入pCHAL1的T-DNA片段的转基因大豆。本专利技术的第二目的在于提供一种所述右侧翼序列在检测转基因大豆中的应用，所述应用通过所述右侧翼序列可以准确判断所述样品是否来自于第3号染色体上第43998179位核苷酸处插入pCHAL1的T-DNA片段的转基因大豆。本专利技术的第三目的在于提供根据所述右侧翼序列设计的PCR引物对，所述引物对通过PCR反应能够快速、准确地检测所述样品的第3号染色体上第43998179位核苷酸处是否插入pCHAL1的T-DNA片段，具有检测方便、特异性好以及准确率高的优点。本专利技术的第四目的在于提供一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒将上述引物对与其他辅助试剂集成在一起，具有使用方便的优点。本专利技术的第五目的在于提供所述引物对或试剂盒的使用方法，通过所述方法可以快速、准确地检测样品的第3号染色体上第43998179位核苷酸处是否插入pCHAL1的T-DNA片段。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术建立在吉林省农业科学院生物所提供的转基因大豆WH8055基础之上。转基因大豆WH8055是通过农杆菌介导大豆子叶节方法将带有HAL1基因的质粒pCHAL1的T-DNA插入到大豆威廉姆斯82的基因组上而获得的转基因大豆，其耐盐性好，农艺性状佳，具有良好的应用前景和育种价值。但在本专利技术之前，尚无人知晓T-DNA在转基因大豆WH8055上的具体插入位点，更加无法建立能够有效鉴定该转基因大豆的方法。本专利技术精心设计3’SP1、3’SP2和3’SP3序列，结合TakaRa公司的GenomeWalkingKit试剂盒，通过TAIL-PCR和测序比对获得转基因大豆WH8055转化时间外源插入载体的右侧翼序列。本专利技术所述右侧翼序列的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，其包括pCHAL1上T-DNA的HAL1基因序列、nos3’UTR序列以及所述T-DNA右侧的大豆基因组序列。由此可见，所述右侧翼序列既包括插入载体的T-DNA序列，又包括其插入位点右侧的大豆基因组序列，只有在第3号染色体第43998179位处插入pCHAL1T-DNA的转基因大豆才具有上述右侧翼序列，pCHAL1以及非转基因大豆或其他转基因大豆都不具备上述右侧翼序列。因此，本专利技术所述右侧翼序列能够特异性地指示在第3号染色体第43998179位处插入pCHAL1T-DNA的转基因大豆，尤其是转基因大豆WH8055或由其转育而成的转基因大豆。基于该序列，可以特异性地检测待测样品是否源自上述转基因大豆，在转基因大豆的检测以及种质资源的鉴定方面具有重要意义和广泛的应用前景。本专利技术还涉及上述右侧翼序列在检测转基因大豆中的应用，所述转基因大豆的第3号染色体第43998179位核苷酸处插入pCHAL1的T-DNA片段；优选地，所述转基因大豆为WH8055或由其转育的转基因大豆。本专利技术所述应用基于上述右侧翼序列，可以通过分子生物学方法，例如PCR、分子杂交，对前述目标转基因大豆进行特异性检测，具有操作简单、准确率高等优点。在一些具体的实施方式中，根据上述右侧翼序列设计用于检测所述转基因大豆的PCR引物对或杂交探针。本专利技术还涉及上述右侧翼序列设计的PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示。本专利技术所述引物对分别设计在T-DNA和所述T-DNA插入位点右侧的大豆基因组上，只有以目标转基因大豆为模板才能通过所述引物对扩增获得700bp左右的产物，而以pCHAL1、非转基因大豆或其他品种的转基因大豆为模板则无法扩增获得目标产物。因此，本专利技术所述PCR引物对能够用于特异性地检测第3号染色体第43998179位核苷酸处插入pCHAL1的T-DNA片段的转基因大豆，尤其是WH8055或由其转育的转基因大豆。另外，本专利技术所述引物对还具有特异性好、扩增效率高等优点。因此，本专利技术所述引物对对提高转基因材料的鉴定效率、转基因产品的管理与检测，以及种质资源的鉴定具有重要的意义。本专利技术还涉及一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对，以及其他试剂。本专利技术上述试剂盒将上述引物对与PCR用到的其他辅助试剂集成在一起，具有使用方便的优点。在一些具体的实施方式中，所述其他试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的一种或多种。优选地，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。更优选地，所述TaqDNA聚合酶为热启动TaqDNA聚合酶。在一些具体的实施方式中，所述其他试剂包括PCR反应的预混液，所述预混液为DNA聚合酶、dNTPs和PCR反应缓冲液的混合物。本专利技术还涉及上述引物对或上述试剂盒的使用方法，所述方法包括：(1)以待测大豆样品的DNA为模板，使用上述引物对或上述试剂盒中的引物对和其他试剂进行PCR扩增；(2)根据PCR扩增产物判定所述待测大豆的第3号染色体上第43998179位核苷酸处是否插入pCHAL1的T-DNA片段。本专利技术上述使用方法通过简单的PCR方法即可检测样品的第3号染色体上第43998179位核苷酸处是否插入的HAL1基因，具有检测方便、特异性好、以及准确性好的优点。在一些具体的实施方式中，所述PCR反应的退火温度为49～51℃，循环数为28～32次；优本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种转基因大豆WH8055转化事件外源插入载体的右侧翼序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。2.权利要求1所述右侧翼序列在检测转基因大豆中的应用，其特征在于，所述转基因大豆的第3号染色体第43998179位核苷酸处插入pCHAL1的T-DNA片段；优选地，所述转基因大豆为WH8055或由其转育的转基因大豆。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，根据权利要求1所述右侧翼序列设计用于检测所述转基因大豆的PCR引物对或杂交探针。4.根据权利要求1所述右侧翼序列设计的PCR引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQIDNO：6和SEQIDNO：7所示。5.一种PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述引物对，以及其他试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述其他试剂包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、...

【专利技术属性】
技术研发人员：马瑞，蔡勤安，于志晶，尚丽霞，庄丹，王丹，任鹏飞，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22