一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法技术

本发明专利技术涉及一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法。能够精准地将提取的每个样本mRNA都标记上独特的分子条形码，并通过高效的逆转录、合成第二条链将每个样本的mRNA转换成带有独特分子条形码标签的双链DNA，随后通过优化的文库构建方法，可将大量标记了分子条形码的样本混合后，实现高通量样本文库构建及二代测序检测。

【技术实现步骤摘要】
一种大量组织、细胞样本mRNA的分子条形码标记、文库构建、测序的方法
本专利技术涉及一种基于分子条形码标记的大量组织、细胞mRNA建库、测序新方法，可用于高通量同时测序大量样本mRNA表达量，解析各个样本基因表达情况。
技术介绍
随着精准医疗计划的进展，高通量基因测序技术将在以后的疾病精确诊断、疾病亚型分类、精准监控疾病发生发展、精准指导用药、特异疾病相关基因组数据库建立等方面发挥越来越关键作用。尽管测序成本已经显著降低，然而一旦涉及高通量、大量样本的测序，成本依然较高。传统mRNA测序前的文库制备往往是一个样本构建一个测序文库，而且是基因全长建库，然后将构建的文库混合后测序，构建测序文库的高成本将极大限制所能检测的样本数量，较难实现大量样本同时检测；而且由于是基因全长建库，一旦样本数量增加，测序成本也极大增加，因此极大限制了其广泛的运用。因此，基于现有方法的以上不足，本专利技术了一种大量组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)的分子条形码标记、文库构建、测序的新方法。
技术实现思路
本专利技术包含将大量组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)标记分子条形码、逆转录、合成第二条链、文库构建及二代测序整个流程的新方法。所述方案能够精准地将提取的每个样本mRNA都标记上独特的分子条形码，并通过高效的逆转录、合成第二条链将每个样本的mRNA转换成带有独特分子条形码标签的双链DNA，随后通过优化的文库构建方法，可将大量标记了分子条形码的样本混合后，实现高通量样本文库构建及二代测序检测。该分子条形码标记测序方法与现今主流的单个样本文库建库及测序方法比较，极大的降低了构建测序文库及测序的成本。该方法可实现高通量多样本同时建库、测序，可用于研究高通量筛选不同处理因素对同一细胞、组织的影响、或一种处理对全身多个不同组织影响、大量临床样本mRNA测序、或实时活检多个人群血液淋巴细胞表达谱的改变等高通量研究。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术涉及一种用于对大量(多个)组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)逆转录的含分子条形码的寡核苷酸引物序列组合：该序列组合含多个不同且唯一的条形码(barcode)及oligo-dT的寡核苷酸链。优选地，所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illuminai5测序引物序列(如序列ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。本专利技术方法针对的对象即大量的组织、细胞样本的样本数数量范围在1-5000之间均适用，相应的上述序列组合中寡核苷酸链的数量优选为1-210个之间。优选地，当样本数量为1-40个时，该序列组合中寡核苷酸链数量(即X(N)的数量)跟样本数量一致，(比如当样本数量为6个时，该序列组合含6个不同且唯一的条形码及oligo-dT的寡核苷酸链)，当40＜样本数量≤960个时，该序列组合中寡核苷酸链数量为40个(如样本数量为100、200、300时，该序列组合中寡核苷酸链数量为40个)；当960＜样本数量≤5000个时，该序列组合中寡核苷酸链数量至少大于样本数/24，且数量为整数。优选地，该序列组合中，多个寡核苷酸链之间Z1序列相同，T(18-30)中T碱基数量相同。本专利技术中所述大量组织、细胞样本是含polyA尾巴的mRNA的真核生物(例如酵母、小鼠、人、蝾螈等)的正常或异常病变的组织、细胞样本。本专利技术还提供了一种通过逆转录对大量组织、细胞样本信使核糖核酸(mRNA)分子进行条形码标记的方法，该方法包括：mRNA的提取、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本(取1-1000ng总RNA)加入含唯一且不同条形码(barcode)及oligodT的寡核苷酸链(1-10μM)作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illuminai5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。逆转录反应试剂可以兼容任何商业化逆转录酶及缓冲体系。优选地，样本信使核糖核酸(mRNA)的提取可通过液氮速冻、组织研磨或直接裂解后，通过传统的trizol法提取总RNA或直接通过任何商业化RNA提取试剂盒提取。本专利技术还提供了一种用于对大量(多个)组织、细胞样本构建3’端二代测序文库的方法，该方法包括如下步骤：1)、mRNA的提取；2)、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本(取1-1000ng总RNA)加入含唯一且不同条形码(barcode)及oligodT的寡核苷酸链(1-10μM)作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illuminai5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。3).合成第二条cDNA链将大量标记有不同barcode序列的样本通过内参基因荧光定量QPCR检测每个样本的相对摩尔浓度；根据每个样本的相对摩尔浓度，(每个样本取1-1000ng,)将标记有不同条形码的逆转录产物等摩尔浓度混合，并经AMPureXP磁珠(BeckmanCoulter)纯化；将混合、纯化后的逆转录产物，(取1-1000ng,)利用NEB第二条cDNA链合成试剂盒合成第二条cDNA的链。4).文库构建首先将大量标记有不同barcode序列的双链cDNA样本，经AMPureXP磁珠(BeckmanCoulter)纯化后，根据样本浓度，将其用TE(Tris,EDTA,PH7.4)稀释至0.2-1ng/μl，取1.25μl，加入3.75μl预混液[NexteraXT(Illumina)试剂盒中的TagmentDNABuffer(2.5μl)和AmplificationTagmentMix(1.25μl)],涡旋20s，3000g离心5min后，在PCR仪上反应[55℃,10min；10℃,5min]；等温度降到10℃后，马上在反应体系中加入1.25μlNTBuffer终止反应；涡旋20s，3000g离心5min；然后在上述反应体系中依次加入：3.75μlNexteraPCRMasterMix(NPM)，1.25μl的i5端PCR引物，1.25μli7引物，涡旋20s，3000g离心2min后，在PCR仪上反应[72℃,3min；95℃,30s；12循环(95℃,10s；55℃,30s；72℃,60s)；72℃,5min；10℃,5min；]；上述为总反应体系12.5μl，当对最终测序文库的产量需求较大，根据实际需求按倍数放大上述建库反应中每一步的试剂的体积。(如需50μl文库则每步反应的试剂均需增加至原来的4倍)。所述的i5端PCR引物序列为AATGATACGGCGACCACCGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于对大量组织、细胞样本信使核糖核酸逆转录的含分子条形码的寡核苷酸引物序列组合，其特征在于：该序列组合含多个不同且唯一的条形码及oligo‑dT的寡核苷酸链。

【技术特征摘要】
1.一种用于对大量组织、细胞样本信使核糖核酸逆转录的含分子条形码的寡核苷酸引物序列组合，其特征在于：该序列组合含多个不同且唯一的条形码及oligo-dT的寡核苷酸链。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物序列组合，其特征在于：所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码(barcode)序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illuminai5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。3.一种通过逆转录对大量组织、细胞样本mRNA分子进行条形码标记的方法，其特征在于：该方法包括：mRNA的提取、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本加入含唯一且不同条形码及oligo-dT的寡核苷酸链作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illuminai5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基。4.一种用于对大量组织、细胞样本构建3’端二代测序文库的方法，其特征在于：所述大量组织、细胞样本是含polyA尾巴的mRNA的真核生物的正常或异常病变的组织、细胞样本，该方法包括如下步骤：1)、mRNA的提取；2)、mRNA添加分子条形码、逆转录：每个样本加入含唯一且不同条形码及oligo-dT的寡核苷酸链作为特异逆转录引物，进行逆转录，其中所述寡核苷酸链为：Z1-X(N)-T(18-30)，其中X(N)是任意不同且唯一的分子条形码序列，一个X代表ATGC四种脱氧核糖核酸碱基中的任意一个碱基，N为6-8，Z1为任意illuminai5测序引物序列，T(18-30)为18-30个连续脱氧核糖核酸T碱基；3).合成第二条cDNA链将大量标记有不同barcode序列的样本通过内参基因荧光定量QPCR检测每个样本的相对摩尔浓度；根据每个样本的相对摩尔浓度，将标记有不同条形码的逆转录产物等摩尔浓度混合，并经AMPureXP磁珠纯化；将混合、纯化后的逆转录产物，利用NEB第二条cDNA链合成试剂盒合成第二条cDNA的链。4)文库构建首先将大量标记有不同barcode序列的双链cDNA样本，经AMPureXP磁珠(BeckmanCoulter)纯化后，根据样本浓度，将其用TE(Tris,EDTA,PH7.4)稀释至0.2-1ng/μl，取1.25μl，加入3.75μl预混液[NexteraXT(Illumina)试剂盒中的TagmentDNABuffer(2.5μl)和AmplificationTagmentMix(1.25μl)],涡旋20s，3000g离心5min后，在PCR仪上反应[55℃,10min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳宏伟，吴兵兵，李余，潘宗友，安晟锐，刘怡孝，邹晓晖，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33